Sapphire激光掃描系統(tǒng)磷屏成像在助力肺纖維化無創(chuàng)監(jiān)控新突破中的應用
肺纖維化疾病由于缺乏可靠的生物標志物進行風險分層和治療監(jiān)測，給疾病的精確管理帶來挑戰(zhàn)。近年來發(fā)現(xiàn)，單核細胞來源的巨噬細胞(MDMφ)的積累是促進肺纖維化的關鍵因素。因此，跟蹤MDMφ積累的體內(nèi)動力學可望用于肺炎纖維化的評估。
近日，匹茲堡大學在Science Advances雜志（IF：13.6）發(fā)表了題為“Noninvasive assessment of the lung inflammation-fibrosis axis by targeted imaging of CMKLR1”的文章，研究了cmklr1靶向的PET在小鼠纖維化肺損傷模型中監(jiān)測MDMφ積累動力學的潛力，并確定了其作為纖維化肺疾病內(nèi)分型和預后生物標志物的臨床相關性。
1 肺纖維化中的巨噬細胞圖景
為研究CMKLR1在IPF肺免疫細胞中的作用，作者對兩個具有>300,000個免疫細胞的全肺單細胞RNA測序(scRNA-seq)數(shù)據(jù)集進行探索分析。按不同表型，巨噬細胞被分為包含Alv-Mφ (FABP4Hi)和FABP4Int-Mφ的肺泡巨噬細胞，以及3組非肺泡巨噬細胞：SPP1- m φ組、FOLR2-Mφ組及罕見的OLFML3-Mφ群體。
2 CMKLR1表達標志新生MDMφ的富集
兩個數(shù)據(jù)集中，CMKLR1表達在巨噬細胞群體中最常被檢測到(圖1C、D)。FOLR2-Mφ在所有免疫細胞類型中具有最高的檢測頻率及CMKLR1表達，其次是OLFML3-Mφ， SPP1-Mφ等。
與更嚴重的下肺葉相比，IPF上肺葉中促纖維化SPP1+巨噬細胞更少。但CMKLR1+巨噬細胞數(shù)量在上、下肺葉中同樣具有顯著升高（IPF上肺葉：8.4%，下肺葉：8.9%；對照組上肺葉：2.3%，下肺葉：0.8%），相比于終末期SPP1+促纖維化巨噬細胞的升高，可作為更可靠的早期生物標志物。
廣義加性模型(GAMs)顯示，在FOLR2-Mφ和SPP1-Mφ軌跡中，CMKLR1的表達隨著單核細胞特征的下降而上升，當促纖維化基因表達開始時達到峰值，后隨著促纖維化特征的上升逐漸下降（圖1I、J）。表明CMKLR1是新生MDMφ在肺纖維化中富集的標志，可隨著巨噬細胞適應纖維化微環(huán)境并逐漸下降。
圖1. 人類肺部疾病和健康的scRNA-seq分析。(B)按細胞類型標記的細胞UMAP。(C-D) 細胞類型、數(shù)據(jù)集及疾病間標準化的基因表達UMAP和熱圖。(I- J) 基因表達的廣義加性模型(GAM)擬合為上述每條軌跡的擴散偽時間函數(shù)。
3 MDMφ驅(qū)動CMKLR1靶向肽的攝取
博萊霉素氣管給藥后的1、2和4周分別大致對應于肺炎高峰期、持續(xù)肺炎的早期ECM重構及炎癥消退伴纖維化。為便于流式細胞實驗，作者用熒光修飾肽（6CF-CG34）替代NODAGA，合成PET示蹤劑[64Cu]NODAGA-CG34的類似物。結果顯示，基線期的主要免疫細胞群體為組織駐留的肺泡巨噬細胞，MDMφ忽略不計。1周后， MDMφ顯著積累，而肺泡巨噬細胞數(shù)量穩(wěn)定。第2周，MDMφ數(shù)量與1周時相似，但后者數(shù)量大幅增加，且MDMφ表現(xiàn)出與其愈加相似的表型分化（圖2A）。4周后均回落至基線水平。在此期間，肺單核細胞數(shù)量相對穩(wěn)定。
圖2. 流式細胞術鑒定驅(qū)動CMKLR1靶向肽攝取的細胞。(A)肺泡巨噬細胞、間質(zhì)巨噬細胞和MDMφ的鑒定。(B)單核細胞和巨噬細胞亞群絕對數(shù)量的動力學。(D)單核細胞和巨噬細胞群體對6CF- CG34特異性攝取的定量檢測。(E)給藥后攝取6CF- CG34的細胞亞群占比。
相應地，最初2周的MDMφ對6CF-CG34的攝取很高，第4周趨于減少（圖2C、D）。間質(zhì)巨噬細胞僅在給藥后1周有短暫增加，2周后又恢復至基線水平。而肺泡巨噬細胞和單核細胞在此期間均無顯著的6CF-CG34特異性攝取。NK細胞盡管具有顯著攝取，但博來霉素誘導損傷后，其豐度及CMKLR1表達均未變化。
此外，在損傷后1周和2周，6CF-CG34的總攝取顯著增加，且主要由MDMφ的積累驅(qū)動（78%和86%）。4周后降至基線水平，顯示了MDMφ豐度及其CMKLR1表達水平的降低。[64Cu]NODAGA-CG34 PET及體外γ計數(shù)均得到與上述的一致結果。
4 CMKLR1巨噬細胞浸潤的炎性肺區(qū)PET
為驗證[64Cu]NODAGA-CG34 PET提供的CMKLR1巨噬細胞浸潤的炎性肺組織空間圖的準確性，作者隨后對肺部進行磷屏成像（Sapphire激光掃描系統(tǒng)拍攝），并對CMKLR1和巨噬細胞標志物F4/80進行免疫熒光染色(圖5)。體內(nèi)PET檢測的示蹤劑攝取與相應的離體磷屏成像之間存在強大的共定位(圖5A、B)，證實了示蹤劑攝取的無創(chuàng)空間定位的準確性。[64Cu]NODAGA-CG34攝取高的區(qū)域與表達CMKLR1的F4/80+巨噬細胞豐富的炎癥區(qū)域相對應(圖5C、D)。可見，[64Cu]NODAGA-CG34 PET可定量監(jiān)測博萊霉素誘導的纖維化肺損傷各階段MDMφ募集的空間定位。
圖5. 博萊霉素處理小鼠1周后， CMKLR1巨噬細胞浸潤的炎性肺區(qū)[64Cu]NODAGA-CG34攝取共定位圖像(A) PET/CT(B)體外放射自顯影（磷屏成像，Sapphire激光掃描成像系統(tǒng)拍攝）(C)蘇木精和伊紅染色和(D)免疫染色組織
5 PET準確預測肺纖維化程度
進一步縱向研究顯示，第1周肺中[64Cu]NODAGA-CG34高攝取的區(qū)域與第4周CT檢測到的嚴重纖維化的區(qū)域相對應，且攝取量與纖維化程度（羥脯氨酸含量及肺衰減量）相關。而第1周的CT實變與纖維化程度僅為弱相關或不相關。可見，肺損傷早期[64Cu]NODAGA-CG34的攝取可準確預測纖維化嚴重程度和分布，有效補充CT獲得的解剖學信息。
圖6. [64Cu]NODAGA-CG34 PET對早期肺纖維化的預測。肺部[64Cu]NODAGA-CG34攝取與第四周羥脯氨酸含量(C)及肺衰減 (D)相關。第1周的CT實變與第4周羥脯氨酸弱相關(E)，與肺衰減無顯著相關(F)。
6 CMKLR1有助識別IPF炎性內(nèi)型
對三個地點的IPF患者縱向隊列二次分析顯示，與對照組相比，IPF患者支氣管肺泡灌洗（BAL）細胞中的CMKLR1表達更高，且呈現(xiàn)明顯的異質(zhì)性。轉(zhuǎn)錄組分析顯示，CMKLR1高表達患者中，趨化因子/趨化因子受體（如CCL2、CCL7）、細胞因子/細胞因子受體（如IL1R2、IL12RB2）及ECM重塑等炎癥相關基因表達上調(diào)（圖7B），或可助于識別IFP不同炎癥內(nèi)型。
CMKLR1表達具有作為預后生物標志物的潛力，與年齡、性別、研究地點和GAP（性別-年齡生理學）指數(shù)無關。CMKLR1表達越高，預后逐漸惡化。
此外，在不同水平GAP指數(shù)的患者分層中，CMKLR1表達均顯示與生存率的相關性。ROC分析顯示，CMKLR1在短期至中期隨訪期間的預測能力優(yōu)于GAP評分，可望提供現(xiàn)有臨床工具外更豐富的風險分層信息。
圖7. CMKLR1高表達可識別炎癥性和預后不良的IPF內(nèi)型。(D)基于CMKLR1表達的Kaplan-Meier生存曲線。(E、F) GAP評分分層后的Kaplan-Meier生存曲線表明，CMKLR1高表達預示著較差的生存。(G、H) CMKLR1表達及GAP評分預測BAL術后死亡率的ROC曲線。
7 CMKLR1在各類纖維化肺病中的表達
作者利用現(xiàn)有的生物庫進一步探索分析，發(fā)現(xiàn)IPF、結節(jié)病、硬皮病、類風濕關節(jié)炎和煤礦工人塵肺患者肺中存在表達CMKLR1的白細胞，提供了CMKLR1在各種纖維化肺疾病中表達的組織學證據(jù)。但由于移除的肺通常代表終末期的疾病特征，仍需進一步研究來闡明CMKLR1在這些疾病中的特異性表達，及其用于疾病內(nèi)分型和風險分層的潛在用途。
8 總結與討論
本研究建立了CMKLR1作為纖維化肺病中富集MDMφ的生物標志物，證明了CMKLR1靶向PET無創(chuàng)監(jiān)測MDMφ積累和纖維化程度預測的準確性，并顯示出其對IPF分子內(nèi)分型的應用前景。
原文鏈接：
https://www.science.org/doi/full/10.1126/sciadv.adm9817
近日，匹茲堡大學在Science Advances雜志（IF：13.6）發(fā)表了題為“Noninvasive assessment of the lung inflammation-fibrosis axis by targeted imaging of CMKLR1”的文章，研究了cmklr1靶向的PET在小鼠纖維化肺損傷模型中監(jiān)測MDMφ積累動力學的潛力，并確定了其作為纖維化肺疾病內(nèi)分型和預后生物標志物的臨床相關性。
1 肺纖維化中的巨噬細胞圖景
為研究CMKLR1在IPF肺免疫細胞中的作用，作者對兩個具有>300,000個免疫細胞的全肺單細胞RNA測序(scRNA-seq)數(shù)據(jù)集進行探索分析。按不同表型，巨噬細胞被分為包含Alv-Mφ (FABP4Hi)和FABP4Int-Mφ的肺泡巨噬細胞，以及3組非肺泡巨噬細胞：SPP1- m φ組、FOLR2-Mφ組及罕見的OLFML3-Mφ群體。
2 CMKLR1表達標志新生MDMφ的富集
兩個數(shù)據(jù)集中，CMKLR1表達在巨噬細胞群體中最常被檢測到(圖1C、D)。FOLR2-Mφ在所有免疫細胞類型中具有最高的檢測頻率及CMKLR1表達，其次是OLFML3-Mφ， SPP1-Mφ等。
與更嚴重的下肺葉相比，IPF上肺葉中促纖維化SPP1+巨噬細胞更少。但CMKLR1+巨噬細胞數(shù)量在上、下肺葉中同樣具有顯著升高（IPF上肺葉：8.4%，下肺葉：8.9%；對照組上肺葉：2.3%，下肺葉：0.8%），相比于終末期SPP1+促纖維化巨噬細胞的升高，可作為更可靠的早期生物標志物。
廣義加性模型(GAMs)顯示，在FOLR2-Mφ和SPP1-Mφ軌跡中，CMKLR1的表達隨著單核細胞特征的下降而上升，當促纖維化基因表達開始時達到峰值，后隨著促纖維化特征的上升逐漸下降（圖1I、J）。表明CMKLR1是新生MDMφ在肺纖維化中富集的標志，可隨著巨噬細胞適應纖維化微環(huán)境并逐漸下降。
3 MDMφ驅(qū)動CMKLR1靶向肽的攝取
博萊霉素氣管給藥后的1、2和4周分別大致對應于肺炎高峰期、持續(xù)肺炎的早期ECM重構及炎癥消退伴纖維化。為便于流式細胞實驗，作者用熒光修飾肽（6CF-CG34）替代NODAGA，合成PET示蹤劑[64Cu]NODAGA-CG34的類似物。結果顯示，基線期的主要免疫細胞群體為組織駐留的肺泡巨噬細胞，MDMφ忽略不計。1周后， MDMφ顯著積累，而肺泡巨噬細胞數(shù)量穩(wěn)定。第2周，MDMφ數(shù)量與1周時相似，但后者數(shù)量大幅增加，且MDMφ表現(xiàn)出與其愈加相似的表型分化（圖2A）。4周后均回落至基線水平。在此期間，肺單核細胞數(shù)量相對穩(wěn)定。
相應地，最初2周的MDMφ對6CF-CG34的攝取很高，第4周趨于減少（圖2C、D）。間質(zhì)巨噬細胞僅在給藥后1周有短暫增加，2周后又恢復至基線水平。而肺泡巨噬細胞和單核細胞在此期間均無顯著的6CF-CG34特異性攝取。NK細胞盡管具有顯著攝取，但博來霉素誘導損傷后，其豐度及CMKLR1表達均未變化。
此外，在損傷后1周和2周，6CF-CG34的總攝取顯著增加，且主要由MDMφ的積累驅(qū)動（78%和86%）。4周后降至基線水平，顯示了MDMφ豐度及其CMKLR1表達水平的降低。[64Cu]NODAGA-CG34 PET及體外γ計數(shù)均得到與上述的一致結果。
4 CMKLR1巨噬細胞浸潤的炎性肺區(qū)PET
為驗證[64Cu]NODAGA-CG34 PET提供的CMKLR1巨噬細胞浸潤的炎性肺組織空間圖的準確性，作者隨后對肺部進行磷屏成像（Sapphire激光掃描系統(tǒng)拍攝），并對CMKLR1和巨噬細胞標志物F4/80進行免疫熒光染色(圖5)。體內(nèi)PET檢測的示蹤劑攝取與相應的離體磷屏成像之間存在強大的共定位(圖5A、B)，證實了示蹤劑攝取的無創(chuàng)空間定位的準確性。[64Cu]NODAGA-CG34攝取高的區(qū)域與表達CMKLR1的F4/80+巨噬細胞豐富的炎癥區(qū)域相對應(圖5C、D)。可見，[64Cu]NODAGA-CG34 PET可定量監(jiān)測博萊霉素誘導的纖維化肺損傷各階段MDMφ募集的空間定位。
5 PET準確預測肺纖維化程度
進一步縱向研究顯示，第1周肺中[64Cu]NODAGA-CG34高攝取的區(qū)域與第4周CT檢測到的嚴重纖維化的區(qū)域相對應，且攝取量與纖維化程度（羥脯氨酸含量及肺衰減量）相關。而第1周的CT實變與纖維化程度僅為弱相關或不相關。可見，肺損傷早期[64Cu]NODAGA-CG34的攝取可準確預測纖維化嚴重程度和分布，有效補充CT獲得的解剖學信息。
6 CMKLR1有助識別IPF炎性內(nèi)型
對三個地點的IPF患者縱向隊列二次分析顯示，與對照組相比，IPF患者支氣管肺泡灌洗（BAL）細胞中的CMKLR1表達更高，且呈現(xiàn)明顯的異質(zhì)性。轉(zhuǎn)錄組分析顯示，CMKLR1高表達患者中，趨化因子/趨化因子受體（如CCL2、CCL7）、細胞因子/細胞因子受體（如IL1R2、IL12RB2）及ECM重塑等炎癥相關基因表達上調(diào)（圖7B），或可助于識別IFP不同炎癥內(nèi)型。
CMKLR1表達具有作為預后生物標志物的潛力，與年齡、性別、研究地點和GAP（性別-年齡生理學）指數(shù)無關。CMKLR1表達越高，預后逐漸惡化。
此外，在不同水平GAP指數(shù)的患者分層中，CMKLR1表達均顯示與生存率的相關性。ROC分析顯示，CMKLR1在短期至中期隨訪期間的預測能力優(yōu)于GAP評分，可望提供現(xiàn)有臨床工具外更豐富的風險分層信息。
7 CMKLR1在各類纖維化肺病中的表達
作者利用現(xiàn)有的生物庫進一步探索分析，發(fā)現(xiàn)IPF、結節(jié)病、硬皮病、類風濕關節(jié)炎和煤礦工人塵肺患者肺中存在表達CMKLR1的白細胞，提供了CMKLR1在各種纖維化肺疾病中表達的組織學證據(jù)。但由于移除的肺通常代表終末期的疾病特征，仍需進一步研究來闡明CMKLR1在這些疾病中的特異性表達，及其用于疾病內(nèi)分型和風險分層的潛在用途。
8 總結與討論
本研究建立了CMKLR1作為纖維化肺病中富集MDMφ的生物標志物，證明了CMKLR1靶向PET無創(chuàng)監(jiān)測MDMφ積累和纖維化程度預測的準確性，并顯示出其對IPF分子內(nèi)分型的應用前景。
原文鏈接：
https://www.science.org/doi/full/10.1126/sciadv.adm9817
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