帕金森病造模方法盤點和技巧全解析

"科研汪" 們一定都有各自的鼠崽子，Of Course，想當年，小 M 做實驗滴時候，動物房隔壁還專門設(shè)有個冰箱——放置鼠崽子的  尸體  Body! (向科研小鼠致敬)

言歸正傳~帕金森病 (Parkinson’s disease, PD) 是繼阿爾茨海默病之后第二大最常見的退行性疾病，常發(fā)生于中老年群體。PD 是多個基因和環(huán)境因素相互作用的結(jié)果，發(fā)病機制復(fù)雜。主要包括：氧化應(yīng)激、線粒體功能障礙、α-突觸核蛋白失衡、神經(jīng)炎癥、腸道微生物紊亂 (圖 1)。

  圖 1. 帕金森病的發(fā)病機制^[1]。

約 10% 的 PD 病例是由基因突變引起的，采用基因突變的動物模型有利于了解 PD 的發(fā)病機制或進展，并找到潛在的治療靶點。

不過，基因模型的病理和行為表型通常與人類狀況有差異。例如，幾乎所有這些基因模型中都未發(fā)現(xiàn)多巴胺能神經(jīng)元的顯著損失 (PD 的主要病理特征)[3]。

圖 2. 帕金森病的遺傳動物模型^[2]。

遺傳模型是根據(jù)人類疾病中發(fā)現(xiàn)的基因突變進行調(diào)整的，如 SNCA (α-synuclein), LRRK2, DJ-1, Parkin, PINK1 基因突變等。這些基因是多巴胺能神經(jīng)元功能的重要信號通路的一部分。

神經(jīng)毒素包括 6-OHDA、MPTP 和魚藤酮 (Rotenone)、百草枯 (Paraquat) 等。急性接觸神經(jīng)毒素會通過破壞線粒體功能和/或增加氧化應(yīng)激而導(dǎo)致運動障礙和黑質(zhì)紋狀體多巴胺能細胞快速死亡，而長期服用神經(jīng)毒素會誘發(fā)進行性模型，其中可能包括誘導(dǎo) α-突觸核蛋白聚集體生成 (圖 3)。

圖 3. 神經(jīng)毒素誘導(dǎo)模型的發(fā)病機制^[3]。

 

• MPTP：穿過血腦屏障，在神經(jīng)膠質(zhì)細胞中被 MAO-B 代謝為 MPP+，然后代謝為活性毒性化合物。MPP+ 隨后被多巴胺轉(zhuǎn)運蛋白吸收，通過抑制電子傳遞鏈的復(fù)合物 I 來損害線粒體呼吸，從而引起氧化應(yīng)激和程序性細胞死亡分子途徑的激活。

• Paraquat 和 6-OHDA 容易通過多巴胺轉(zhuǎn)運蛋白穿過細胞膜，也可能通過靶向線粒體發(fā)揮毒性，隨后產(chǎn)生 ROS 和醌，導(dǎo)致黑質(zhì)紋狀體多巴胺能神經(jīng)元退化。
• Rotenone 具有極強的疏水性，容易穿透細胞膜，誘導(dǎo) α‐突觸核蛋白聚集體的形成和線粒體損傷，隨后產(chǎn)生 ROS 和醌。

下面是小 M 為大家整理的 PD 神經(jīng)毒素模型的方法、特點和應(yīng)用，大家可以點贊收藏喔~

 

表 1. 神經(jīng)毒素模型的方法、特點和應(yīng)用^{[4][5][6][7][8]}。 

 

目前，MPTP 模型已成為最常用的模型。其是唯一已知的能夠在人類和猴子中引起與 PD 臨床表現(xiàn)相似的多巴胺能神經(jīng)毒素。同時，MPTP 使用方便，不需要任何特殊設(shè)備 (例如立體定位框架)，也不需要像 6-OHDA 或魚藤酮那樣對活體動物進行手術(shù)。此外，MPTP 在全身給藥后會產(chǎn)生可靠且可重復(fù)的黑質(zhì)紋狀體多巴胺能通路病變，而其他毒素通常不會出現(xiàn)這種情況[2]。

當然，在進行 MPTP 的造模時，也要注意鼠的選擇，注射方式，給藥方案等，提高造模成功率！

MPTP 的毒性作用會導(dǎo)致黑質(zhì)紋狀體損傷，紋狀體多巴胺耗竭，黑質(zhì)致密部 (SNpc) 和紋狀體末端酪氨酸羥化酶 (Tyrosine hydroxylase, TH) 陽性神經(jīng)元減少 (圖 4)。
如何判斷造模成功？[9][10]：

•  黑質(zhì)紋狀體損傷: 造模成功后黑質(zhì)和紋狀體區(qū)域 TH 減少 (IHC, IF, WB 等方法都可以);

• 大腦神經(jīng)遞質(zhì) DA, DOPAC, 5-HT, HVA 等減少 (可通過 HPLC 檢測);

• 黑質(zhì)紋狀體小膠質(zhì)細胞 (IBA1⁺ cells) 和星形膠質(zhì)細胞 (GFAP⁺ cells) 激活, 黑質(zhì)區(qū) α-syn 聚集體數(shù)量增加。

圖 4. MPTP 造模后腦內(nèi)多巴胺含量變化及 TH 陽性神經(jīng)元免疫組化染色^[2]。

A-C. 多巴胺 (DA) 及其主要代謝物 DOPAC 和 HVA 的含量變化。在第一次和最后一次 MPTP 注射（18 mg/kg, i.p. 分 4 次注射，間隔 2 小時）后 0.5-1.0 小時用藥物治療小鼠。藥物繼續(xù)使用 4 天。在最后一次 MPTP 給藥后 7 天殺死小鼠。收集大腦，HPLC 測定多巴胺和代謝物水平。D-F. 黑質(zhì)致密部 (SNpc) 和紋狀體 TH 陽性神經(jīng)元的免疫組化染色和定量。注射 MPTP 后第 7 天取腦染色，在注射鹽水的對照組中，SNpc 和紋狀體末端存在密集的 TH 陽性細胞體和纖維網(wǎng)絡(luò)。注射 MPTP 后，SNpc 和紋狀體中的 TH 含量急劇降低。

 

 

PD 小鼠模型的神經(jīng)損傷評價是多層面、多指標并存的。運動技能、學(xué)習和記憶障礙等指標可以共同評估動物的運動能力、姿勢和協(xié)調(diào)性。

▐  Open Field Test 曠場試驗

500×500×300 mm 曠場，曠場底面被平均分為 16 個 4×4 個小方格。正上方架攝像頭，視野覆蓋整個曠場。將動物放置在正中央格，同時進行攝像和計時，時間為 5 min。

通過計算機示蹤分析系統(tǒng)分析實驗動物的水平活動 (中央格停留時間、穿過中央格的次數(shù)、梳毛次數(shù)) 和直立次數(shù)，能夠反映動物的焦慮情況。

圖 5. 小鼠曠場試驗示意圖^[11]。

 

▐  Rotarod test 轉(zhuǎn)棒試驗

將小鼠置于直徑為 3 cm 的旋轉(zhuǎn)桿上，轉(zhuǎn)速調(diào)整為 30 r/min。記錄小鼠從置于轉(zhuǎn)棒到掉落轉(zhuǎn)棒所經(jīng)歷的時間，測定時間為 1 min，每次中間休息 1 min，連續(xù) 5 次，并記錄 1 min 內(nèi)小鼠掉落次數(shù)，能夠反映動物的運動協(xié)調(diào)能力。
▐  Morris 水迷宮
水迷宮實驗是評估嚙齒類動物空間學(xué)習和記憶能力的經(jīng)典程序，由一個圓形水池、水下平臺以及一套圖像自動采集和處理系統(tǒng)組成。
通過觀測和記錄動物學(xué)會在水箱內(nèi)游泳并找到水下平臺的耗時、游泳軌跡和搜索策略，分析和推斷動物的學(xué)習、記憶和空間認知等方面的能力。

圖 6. Morris 水迷宮示意圖^[12]。
 

▐  Pole test 爬桿測試

將一根 1 cm 粗、50 cm 長的木棒固定在實驗臺之上，用紗布繞棒包裹以防止小鼠攀爬滑動。將木棒豎直放置，將小鼠放置于木棒下方，計算小鼠到木棒上方并折返回到桿的底部的時間。每只小鼠完成 3 次，兩次實驗之間的間隔在 10 min 以上，取三次的平均時間作為最后結(jié)果。

 

▐  酪氨酸羥化酶 (TH)

酪氨酸羥化酶 (Tyrosine Hydroxylase, TH) 負責催化 L-酪氨酸羥化并以四氫生物蝶呤 (BH4) 為輔酶生成左旋多巴。作為介導(dǎo)多巴胺生物合成的關(guān)鍵限速步驟，PD 動物模型黑質(zhì)中 TH 陽性多巴胺能神經(jīng)元會顯著減少。

圖 7. 小鼠紋狀體 (Striatum) 和黑質(zhì) (SNpc) 中 TH 的免疫組化染色^[13]。 

▐  α-突觸核蛋白 (α-synuclein)

帕金森病典型的病理學(xué)特征為 α-synuclein 在中腦黑質(zhì)-紋狀體區(qū)的異常聚集，造成多巴胺能神經(jīng)元死亡。

圖 8. 大鼠模型中紋狀體內(nèi)注射 α-syn-PFF 引起的突觸前和突觸后功能障礙^[14]。

左圖：在皮質(zhì)區(qū)，注射 α-syn-PFFs 的大鼠檢測到了一致比例的 p-α-syn+神經(jīng)元。自發(fā)突觸電流分析表明，背側(cè)紋狀體靶神經(jīng)元中自發(fā)興奮性突觸后電流的頻率增加，從而導(dǎo)致高谷氨酸能活動狀態(tài)。

右圖：α-syn-PFF 大鼠的 SNpc 呈現(xiàn)多巴胺能神經(jīng)元數(shù)量減少，表現(xiàn)為 TH+免疫熒光減少，與自發(fā)放電活動異常增加有關(guān)。中間圖：在背外側(cè)紋狀體中，注射 α-syn-PFFs 導(dǎo)致 SPN 中皮質(zhì)紋狀體長期可塑性發(fā)生重大改變。還觀察到 TH+纖維顯著減少和 SNpc 終端內(nèi)源性多巴胺釋放減少.

 

MCE 可提供高純度，生物活性經(jīng)過驗證的 MPTP，產(chǎn)品已經(jīng)過專業(yè)的生物驗證，更是得到全球客戶的認可。

實驗方案：

20 mg/kg 或 23.4 mg/kg，腹腔注射，每隔 2 h 注射一次，一天內(nèi)打 4 次。12 周雄性 C57BL/6N 小鼠。給藥完 7 天后取材 (有文獻表明急性給藥后第7天黑質(zhì)紋狀體損傷達到穩(wěn)定)[5]。

• 紋狀體 TH 平均清除率：60% (20 mg/kg)，79% (23.4 mg/kg)；

• 黑質(zhì)致密部 (SNpc) TH 平均清除率：43% (20 mg/kg)，47% (23.4 mg/kg)。

   

 

圖 9. MCE MPTP 誘導(dǎo)小鼠帕金森病急性模型 TH 免疫組化染色。

A. 紋狀體，B. 黑質(zhì)


萌家小貼士：

1. 造模小鼠不一定會出現(xiàn)帕金森病行為缺陷，小鼠個體差異性也較大,造模成功率一般難達 100%，因此在 MPTP 小鼠研究中要監(jiān)測的主要表型是與神經(jīng)膠質(zhì)增生相關(guān)的黑質(zhì)紋狀體損傷，其程度取決于劑量和給藥方案[1][4][5]。

2. 造模后可能會死亡：一個常見問題是動物在開始給藥后的前 24 小時內(nèi)急性死亡，雌性小鼠的死亡率較高。值得注意的是，急性死亡與大腦多巴胺能系統(tǒng)的損傷無關(guān)，有可能是由于外周心血管副作用。藥物劑量高/小鼠體重小于 22 g/不同批次藥物混用/小鼠沒有提前適應(yīng)/動物房太冷均有可能會導(dǎo)致小鼠死亡，每組動物數(shù)目建議增大。

3. 注射后，肉眼可以注意觀察小鼠是否有活動性減弱、走路踉蹌，抽搐、炸毛，排尿變多等表現(xiàn)，這種行為可能可以持續(xù) 24-48 h，此后小鼠表現(xiàn)基本正常。

今天給大家盤點了帕金森的不同模型的發(fā)生機制、不同的造模方式以及行為學(xué)/病理學(xué)評價等，主要給大家介紹了如何用 MPTP 造模，大家可以根據(jù)自己的實驗需求選擇合適的造模方式。如需幫助，可聯(lián)系萌家線下銷售經(jīng)理或者技術(shù)獲取技術(shù)支持，助您的實驗一臂之力~

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MPTP hydrochloride 透過血腦屏障的多巴胺神經(jīng)毒素，可用于誘導(dǎo)帕金森綜合癥模型

6-OHDA 一種廣泛應(yīng)用的神經(jīng)毒素，可選擇性破壞多巴胺能神經(jīng)元

Rotenone 線粒體電子傳遞鏈復(fù)合物 I 抑制劑

Tyrosine Hydroxylase Antibody 酪氨酸羥化酶抗體

alpha Synuclein Antibody (YA2073) α-突觸核蛋白抗體

[1] Jankovic J, et al. Parkinson's disease: etiopathogenesis and treatment. J Neurol Neurosurg Psychiatry. 2020 Aug;91(8):795-808.

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[3] Javier Blesa, et al. Animal Models of Parkinson’s Disease. Challenges in Parkinson's Disease. 2016.

[4] Konnova EA, et al. Animal Models of Parkinson’s Disease. In: Stoker TB, Greenland JC, editors. Parkinson’s Disease: Pathogenesis and Clinical Aspects [Internet]. Brisbane (AU): Codon Publications; 2018 Dec 21. Chapter 5.

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[9] Rabaneda-Lombarte N, et al. The CD200R1 microglial inhibitory receptor as a therapeutic target in the MPTP model of Parkinson's disease. J Neuroinflammation. 2021 Apr 6;18(1):88.

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