高通量球狀體形成和遷移研究：TeloCol-10的應(yīng)用及其穩(wěn)定性的提升

使用Advanced BioMatrix的TeloCol-10進(jìn)行生物打印球狀體時(shí)，TeloCol-10相比Matrigel在更長(zhǎng)的孵育時(shí)間內(nèi)表現(xiàn)出更好的穩(wěn)定性。

1 文章
Title：“High-throughput Spheroid Formation and Migration with T eloCol-10 for Improved  Stability”

作者：Paulo Godoy, PhD; Itedale Namro Redwan, PhD Gothenburg, Sweden

摘要：1型膠原蛋白和Matrigel是3D細(xì)胞培養(yǎng)的金標(biāo)準(zhǔn)，最近被用于3D生物打印研究。然而，關(guān)于天然基質(zhì)在高通量球體形成和遷移的生物打印模型上的可擴(kuò)展性，仍然存在認(rèn)知差距。在該案例中，我們證明了在相同條件下，與Matrigel相比，1型膠原蛋白(在本例中為TeloCol®-10)在更長(zhǎng)的孵育時(shí)間內(nèi)支持乳腺癌細(xì)胞球形形成和遷移，具有更高的穩(wěn)定性。盡管Matrigel是促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)和遷移的金標(biāo)準(zhǔn)，但在介質(zhì)交換過(guò)程中，液滴很容易分離，并且在測(cè)試條件下，隨著時(shí)間的推移，可以觀察到降解的跡象。

2 前言
在天然基質(zhì)中，膠原蛋白和Matrigel被認(rèn)為是3D細(xì)胞培養(yǎng)的黃金標(biāo)準(zhǔn)，因?yàn)樗鼈兡軌蚰�擬體內(nèi)細(xì)胞-細(xì)胞基質(zhì)(ECM)的相互作用。Matrigel具有膠原蛋白和其他天然水凝膠的許多優(yōu)點(diǎn)，已被用于研究細(xì)胞遷移、血管生成和腫瘤發(fā)展(Kleinman, 2005)。它來(lái)源于Engelbreth-Holm-Swarm小鼠肉瘤分離的ECM，含有層粘連蛋白、4型膠原蛋白、腸動(dòng)蛋白，以及幾種生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子和許多其他低豐度的肽/蛋白，通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)分析鑒定，達(dá)到1851個(gè)蛋白(Hughes, 2010)。除了Matrigel的多功能性外，還有一些缺點(diǎn)限制了它在藥物發(fā)現(xiàn)和疾病建模中的應(yīng)用，包括成分的高批次差異(Hughes, 2010)，腫瘤生長(zhǎng)因子/肽可能不是所有器官或疾病的最佳選擇(Mahoney, 2008)，對(duì)機(jī)械性能的控制較差，以及樣品的不均勻剛度(Reed, 2009)。

另外，膠原蛋白支持3D細(xì)胞培養(yǎng)，不含Matrigel所含的癌源性生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子。膠原蛋白是天然組織的主要有機(jī)成分，在已確定的29種類型中，1型膠原蛋白最為常見(Shoulders, 2009)。由于其結(jié)構(gòu)特性、生物相容性、滲透性和可降解性，膠原基水凝膠是復(fù)制組織發(fā)育、再生和腫瘤生物學(xué)的理想選擇(Sapudom, 2018)。

TeloCol-10含有95%的1型膠原蛋白和5%的3型膠原蛋白(都來(lái)自牛)。它保留了端肽區(qū)域，從而增加了硬度，這在培養(yǎng)中比不含端肽的膠原蛋白提供了更多的穩(wěn)定性。更穩(wěn)定的水凝膠可能有利于諸如基于液滴的球體形成和遷移分析等應(yīng)用，這些應(yīng)用需要更長(zhǎng)的孵育時(shí)間，因?yàn)樵谔砑铀幬镏�前和之后的幾天�?nèi)需要監(jiān)測(cè)細(xì)胞行為。此外，通過(guò)改變TeloCol-10濃度，可以調(diào)節(jié)其硬度以模擬不同的生理?xiàng)l件。其他研究估計(jì)乳腺癌基質(zhì)的硬度約為400至1500 Pa，而正常乳腺組織的硬度約為150 Pa (Cox, 2011)， TeloCol-10的6 mg/mL(≈1200 Pa)和4 mg/mL(≈230 Pa)也得到了類似的值(圖1)。Matrigel稀釋至6 mg/mL時(shí)僅達(dá)到50 Pa (Slater, 2021)。
 

圖1所示：TeloCol-10稀釋為6和4mg /mL的儲(chǔ)存模量
 

3D生物打印革命使得在微孔板中創(chuàng)建可復(fù)制的3D模型成為可能(Blanco-Fernandez, 2021)。然而，關(guān)于天然基質(zhì)在生物打印液滴上的可擴(kuò)展性和穩(wěn)定性，用于高通量球體形成和遷移，以及它們?cè)谒幬锇l(fā)現(xiàn)和腫瘤生物學(xué)研究中的應(yīng)用，還有更多的需要了解。

在本應(yīng)用報(bào)告中，我們比較了1型膠原(TeloCol-10)和Matrigel對(duì)乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231的球體形成和遷移的影響，MDA-MB-231因其侵襲性而常用于晚期乳腺癌的建模。

我們使用CYTENA的CELLCYTE X™活細(xì)胞成像系統(tǒng)生物打印了攜帶細(xì)胞的TeloCol-10或Matrigel液滴，并在5天內(nèi)監(jiān)測(cè)球體的形成，該系統(tǒng)還用于監(jiān)測(cè)生物打印的液滴結(jié)構(gòu)中細(xì)胞從內(nèi)核向外無(wú)細(xì)胞層的遷移(圖2)。
 

圖2. TeloCol-10 或 Matrigel 的3D生物打印的類球體（液滴）和遷移（液滴中液滴）模型及其分析的一般工作流程。

3 材料和方法
3.1 細(xì)胞培養(yǎng)
使用mCherry標(biāo)簽標(biāo)記MDA-MB-231(ATCC,HTB-26)細(xì)胞，培養(yǎng)在DMEM培養(yǎng)基中。培養(yǎng)基含：10% FBS、1% 青鏈霉素（雙抗）；培養(yǎng)環(huán)境：37℃、5% CO2、95% 的濕度。

細(xì)胞在與兩種生物墨水嵌合混合之前要先培養(yǎng)到致密單層。保持細(xì)胞活率在90% 以上。

細(xì)胞無(wú)論是與TeloCol-10還是與Matrigel混合，細(xì)胞的終濃度保持一致（4×106細(xì)胞/ mL）。

3.2 打印前準(zhǔn)備
對(duì)于每種水凝膠，使用兩種不同的濃度：6 mg/mL用于球體形成實(shí)驗(yàn)和遷移實(shí)驗(yàn)的內(nèi)部液滴，4 mg/mL用于遷移實(shí)驗(yàn)的外部液滴。在均質(zhì)步驟之前，所有材料都保存在冰上。

為了從TeloCol-10(10 mg/mL)中獲得4和6 mg/mL的終濃度，根據(jù)制造商的方案對(duì)溶液進(jìn)行中和和稀釋。Matrigel(10.3 mg/mL)僅用細(xì)胞懸液稀釋。將水凝膠與細(xì)胞懸浮液用2支3ml注射器混合，來(lái)回混合30次。

3.3 生物打印的流程
將含有細(xì)胞的TeloCol-10或Matrigel的注射器用22G錐形噴嘴蓋住，裝入CELLINK內(nèi)部開發(fā)的生物分配器（BIO ONE）中，該分配器帶有遇冷打印頭（2℃），并附有隔熱層。

將用于組織培養(yǎng)的96孔板放在打印床上。

球體實(shí)驗(yàn)中，將細(xì)胞包埋在6mg /mL的TeloCol-10或Matrigel溶液中，打印1 µL液滴。

遷移實(shí)驗(yàn)中，將細(xì)胞包埋在6 mg/mL的TeloCol-10或Matrigel中，打印1 μL液滴（內(nèi)滴）。打印液滴后，立即將板置于37°C加濕培養(yǎng)箱中約15分鐘，用于TeloCol-10的熱交聯(lián)。Matrigel板孵育25分鐘。第一滴凝膠后，外滴(5 µL)用4 mg/mL的TeloCol-10或Matrigel打印，在培養(yǎng)箱內(nèi)重復(fù)熱凝膠。每孔加入300 µL培養(yǎng)基，孵育至下游分析。每3天用新鮮培養(yǎng)基替換一半培養(yǎng)基。

3.4 活細(xì)胞成像
CELLCYTE X是一種高通量活細(xì)胞成像系統(tǒng)(具有3個(gè)熒光通道和亮場(chǎng))，可以實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)細(xì)胞活力，長(zhǎng)期孵育。我們實(shí)現(xiàn)了球體分析模式，它可以適應(yīng)于膠原蛋白或基質(zhì)嵌入細(xì)胞。在打印的液滴中加入培養(yǎng)基后，將孔板置于CELLCYTE X中孵育30分鐘，然后開始成像，以減少冷凝。CELLCYTE Studio設(shè)置為每隔3小時(shí)以4倍放大率捕獲每孔的亮場(chǎng)和紅色熒光，持續(xù)5天。

3.5 分析
對(duì)于球體形成試驗(yàn)，編譯了總紅色熒光數(shù)據(jù)。將特定時(shí)間點(diǎn)的紅色熒光歸一化為時(shí)間0的初始紅色熒光。這種歸一化使得比較膠原蛋白和Matrigel結(jié)果成為可能。TeloCol-10分析了59個(gè)液滴，Matrigel分析了52個(gè)液滴。通過(guò)比較TeloCol-10或matrigel包埋細(xì)胞在12個(gè)構(gòu)建體中的不同遷移模式來(lái)分析遷移實(shí)驗(yàn)。

4 結(jié)果與討論
4.1 腫瘤球的生物打印
從第1天到第5天，用CELLCYTE X成像液滴，在4倍放大下捕獲亮場(chǎng)和紅色熒光圖像。乳腺癌細(xì)胞在TeloCol-10中持續(xù)生長(zhǎng)，第3天形成聚集體和球狀體，并持續(xù)生長(zhǎng)至第5天(圖3A)。

在Matrigel(圖3B)中，細(xì)胞在第2天聚集成球體。從第3天開始，Matrigel液滴開始在邊緣降解，將細(xì)胞團(tuán)推向中心，同時(shí)使細(xì)胞在孔上生長(zhǎng)。在第4天和第5天，所有的小球體簇已經(jīng)合并成一個(gè)大的中心簇，而附著在孔板上的細(xì)胞已經(jīng)過(guò)度生長(zhǎng)，占據(jù)了大部分的孔面積。有趣的是，整個(gè)過(guò)程中每3小時(shí)捕獲的紅色熒光顯示，Matrigel和TeloCol-10中的細(xì)胞生長(zhǎng)速度相同(圖4)。
 

圖4. 含有MDA-MB-231 mCherry細(xì)胞的TeloCol-10 (6mg /mL)和Matrigel (6mg /mL)液滴的相對(duì)紅色熒光分析。

細(xì)胞從第1天到第5天由CELLCYTE X系統(tǒng)監(jiān)測(cè)，使用亮場(chǎng)和紅色熒光在4倍放大下獲得圖像。相對(duì)熒光(Ft/Fi)。Ft:特定時(shí)間的總紅色熒光;Fi:時(shí)刻0的總紅色熒光。

對(duì)于藥物測(cè)試方案，細(xì)胞通常在打印后3至7天進(jìn)行處理，此時(shí)3D結(jié)構(gòu)形成相對(duì)穩(wěn)定。在這里，我們演示了TeloCol-10對(duì)于這種特定設(shè)置具有更高的穩(wěn)定性。為了進(jìn)一步評(píng)估Matrigel或TeloCol-10在更復(fù)雜的細(xì)胞模型中的影響，我們采用了使用兩種不同水凝膠剛度的遷移方案。

4.2 癌細(xì)胞在不同基質(zhì)中的侵襲
我們采用了先前測(cè)試過(guò)的滴對(duì)滴的方法來(lái)研究不同水凝膠濃度的影響。該試驗(yàn)需要一個(gè)嵌入細(xì)胞的核心液滴，由一個(gè)無(wú)細(xì)胞的外層液滴覆蓋(Takata, 2009;扎曼,2006)。在本實(shí)驗(yàn)中，我們將含有4x106個(gè)細(xì)胞/mL的1µL的TeloCol-10(6 mg/mL)或Matrigel(6 mg/mL)滴生物打印到96孔板中，以形成嵌入細(xì)胞的中心核心。第一滴聚合后，在核心滴上打印第二滴無(wú)細(xì)胞的TeloCol-10(4 mg/mL)或Matrigel(4 mg/mL)。用CELLCYTE X每3小時(shí)跟蹤一次遷移模型，持續(xù)9天(圖5)。

3天后，可以觀察到細(xì)胞從TeloCol-10和Matrigel的內(nèi)液滴向無(wú)細(xì)胞的外液滴的初始遷移，隨后幾天出現(xiàn)大規(guī)模遷移。此外，當(dāng)細(xì)胞遷移出去時(shí)，內(nèi)層的降解使中心形成球狀簇，就像在球體模型中觀察到的降解一樣。在第7天，Matrigel的外層也開始降解和收縮，移動(dòng)到相同的中心區(qū)域，并留下附著在孔底的細(xì)胞軌跡�？偟膩�(lái)說(shuō)，我們能夠在TeloCol-10模型中跟蹤遷移細(xì)胞長(zhǎng)達(dá)9天，而Matrigel模型中的細(xì)胞在第7天就到達(dá)了外層的邊界。
 

圖5. 癌細(xì)胞遷移的滴對(duì)滴模型。內(nèi)核中含有活的MDA-MB-231 mCherry(4×106個(gè)細(xì)胞/mL，紅色)，包埋在1µL液滴中的A)TeloCol-10(6 mg/mL)或B) Matrigel(6 mg/mL)中，然后用5 µL無(wú)細(xì)胞的TeloCol-10或Matrigel(4 mg/mL)覆蓋內(nèi)液滴。細(xì)胞用CELLCYTE X系統(tǒng)(4倍亮場(chǎng)和紅色熒光)監(jiān)測(cè)9天。液滴降解僅在Matrigel中明顯。

在球體形成和遷移實(shí)驗(yàn)中，Matrigel的降解與生長(zhǎng)細(xì)胞的蛋白質(zhì)水解消化有關(guān)，且小液滴體積、高水凝膠濃度和高細(xì)胞濃度可能促進(jìn)降解。薄層中的Matrigel會(huì)形成異常結(jié)構(gòu)，細(xì)胞生長(zhǎng)傾向于單層。此外，Matrigel的蛋白質(zhì)和生長(zhǎng)因子組成變化會(huì)影響其機(jī)械性能、細(xì)胞生長(zhǎng)、遷移和實(shí)驗(yàn)可重復(fù)性。在更換介質(zhì)或添加藥物時(shí)，Matrigel液滴會(huì)從孔底分離，而TeloCol-10液滴則穩(wěn)定粘附在孔中心。TeloCol-10的穩(wěn)定性歸因于其適中的硬度和額外的交聯(lián)點(diǎn)（TeloCol-10保留了膠原蛋白的端肽區(qū)域），以及超過(guò)99%的純度，而Matrigel含有多種活性生長(zhǎng)因子，可能影響細(xì)胞活動(dòng)，需謹(jǐn)慎解釋其結(jié)果。

5 結(jié)論
* 在相同濃度下，TeloCol-10與Matrigel具有相似的生長(zhǎng)速率，可促進(jìn)乳腺癌球體的形成和遷移。
* 在腫瘤球體實(shí)驗(yàn)中，6 mg/mL的Matrigel在4天后出現(xiàn)降解，在癌細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)中，內(nèi)滴(6 mg/mL，含細(xì)胞)和外滴(4 mg/mL，不含細(xì)胞)在6和7天后出現(xiàn)降解。在兩種試驗(yàn)中，TeloCol-10均未顯示出降解跡象。
* 與Matrigel相比，TeloCol-10的高硬度膠原蛋白在更長(zhǎng)的培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)保持液滴結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，并且含有更少的生長(zhǎng)因子，這使得TeloCol-10成為高通量生物打印的更好選擇。

6 參考文獻(xiàn)
見網(wǎng)址：
https://go.pardot.com/l/894101/2022-04-04/49b9sw/894101/1649077362zEhwPlOq/AppNote_TeloCol_10_CELLCYTE_Biodispenser_20220404.pdf