高效液相色譜儀柱壓?jiǎn)栴}、漂移問題等常見故障及解決方法介紹

高效液相色譜（HPLC）是近30年發(fā)展起來的一種具有高靈敏度、高選擇性的高效快速分離分析技術(shù)。它既能用于微量組分的分析測(cè)定，又能用于大量的制備分離，靈活多樣，其應(yīng)用范圍已超過其他各種分離方法，尤其在中藥樣品的分析分離方面更充分發(fā)揮它的特長(zhǎng)，為推動(dòng)該領(lǐng)域的進(jìn)步和發(fā)展作出了巨大貢獻(xiàn)。

高效液相色譜在使用過程中常會(huì)出現(xiàn)一些影響分析結(jié)果的問題，如果使用人員了解常見問題及其成因和相關(guān)解決方法，就能做到早預(yù)防勤維護(hù)，使分析結(jié)果保持較好的穩(wěn)定性與較高的精確性。

高效液相色譜儀系統(tǒng)組成：液相色譜儀主要由貯液瓶、泵、進(jìn)樣器、柱子、柱溫箱、檢測(cè)器、數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)組成。對(duì)于整個(gè)系統(tǒng)而言，柱子、泵和檢測(cè)器是核心部件同時(shí)也是易出問題的主要部位。

高效液相作為一種高精密儀器，如果在使用過程中不按照正確操作的話，就容易導(dǎo)致一些問題。其中最常見的就是柱壓?jiǎn)栴}、漂移問題、峰型異常問題。

柱壓?jiǎn)栴}
柱壓?jiǎn)栴}是使用高效液相色譜儀過程中需要密切注意的地方，柱壓的穩(wěn)定與色譜圖峰形的好壞、柱效、分離效果及保留時(shí)間等密切相關(guān)。所謂柱壓穩(wěn)定并不是指壓力值穩(wěn)定于一個(gè)恒定值而是指壓力波動(dòng)范圍在50 PSI（3.3 Bar）之間（在使用梯度洗脫時(shí)，柱壓平穩(wěn)緩慢的變化是允許的）。壓力過高、過低都屬于柱壓?jiǎn)栴}。

壓力過高
這是高效液相色譜儀在使用中最常見的問題，指的是壓力突然升高，一般都是由于流路中有堵塞的原因。此時(shí)，我們應(yīng)該分段進(jìn)行檢查。
1）首先斷開真空泵的入口處，此時(shí)PEEK管里充滿液體，使PEEK管低于溶劑瓶，看液體是否自由滴下，如果液體不滴或緩慢滴下，則是溶劑過濾頭堵塞。
處理方法：用30%的硝酸浸泡半個(gè)小時(shí)，在用超純水沖洗干凈。如果液體自由滴下，溶劑過濾頭正常，再檢查；

2）打開Purge閥，使流動(dòng)相不經(jīng)過柱子，如果壓力沒有明顯下降，則是過濾白頭堵塞。
處理方法：將過濾白頭取出，用10%的異丙醇超聲半個(gè)小時(shí)。如果壓力降至100 PSI（6.7 Bar）以下，過濾白頭正常，再檢查；

3）把色譜柱出口端取下，如果壓力不下降，則是柱子堵塞。
處理方法：如果是緩沖鹽堵塞，則用95%的水沖至壓力正常。如果是一些強(qiáng)保留的物質(zhì)導(dǎo)致堵塞，則要用比現(xiàn)在流動(dòng)相更強(qiáng)的流動(dòng)相沖至壓力正常。假如按上面的方法長(zhǎng)時(shí)間沖洗壓力都不下降，則可考慮將柱子的進(jìn)出口反過來接在儀器上，用流動(dòng)相沖洗柱子。這時(shí)，如果柱壓仍不下降，只有換柱子入口篩板，但一旦操作不甚，很容易造成柱效下降，所以盡量少用。

壓力過低
1）壓力過低的現(xiàn)象一般是由于系統(tǒng)泄漏，處理方法：尋找各個(gè)接口處，特別是色譜柱兩端的接口，把泄漏的地方旋緊即可；
2）當(dāng)然還有一個(gè)原因就是泵里進(jìn)了空氣，但此時(shí)表現(xiàn)的往往是壓力不穩(wěn)，忽高忽低，更嚴(yán)重一點(diǎn)會(huì)導(dǎo)致泵無法吸上液體。處理方法：打開Purge閥，用3~5 ml/min的流速?zèng)_洗，如果不行，則要用專用針筒在排空閥處借住外力將氣泡吸出。

漂移問題
主要包括基線漂移和保留時(shí)間漂移。

基線漂移
一般說來，機(jī)器剛起動(dòng)時(shí)，基線容易漂移，大概要半個(gè)小時(shí)的平衡時(shí)間，如果你用了緩沖溶液或緩沖鹽，還有就是在低波長(zhǎng)下（220 nm）平衡時(shí)間相對(duì)會(huì)比較長(zhǎng)，但如果你在實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)基線漂移，則你要考慮下面的原因：
1）柱溫波動(dòng)。解決方法：控制好柱子和流動(dòng)相的溫度，檢查是否有打開的窗戶或空調(diào)對(duì)著柱溫箱；
2）流通池被污染或有氣體。解決方法：用甲醇或其他強(qiáng)極性溶劑沖洗流通池（最好斷開柱子）。如有需要，可以用1N的硝酸（不要用鹽酸）；
3）紫外燈能量不足。解決方法：更換新的紫外燈；
4）流動(dòng)相污染、變質(zhì)或由低品質(zhì)溶劑配成。
解決方法：檢查流動(dòng)相的組成，使用高品質(zhì)的化學(xué)試劑及HPLC級(jí)的溶劑；
5）樣品中有強(qiáng)保留的物質(zhì)（高K’值）以饅頭峰樣被洗脫出，從而表現(xiàn)出一個(gè)逐步升高的基線。
解決方法：使用保護(hù)柱，如有必要，在進(jìn)樣之間。在分析過程中，定期用強(qiáng)溶劑沖洗柱子；
6）檢測(cè)器沒有設(shè)定在最大吸收波長(zhǎng)處。解決方法：將波長(zhǎng)調(diào)整至最大吸收波長(zhǎng)處；
7）流動(dòng)相的PH值沒有調(diào)節(jié)好。解決方法：加適量的酸或堿調(diào)至最佳PH值。

保留時(shí)間漂移
保留時(shí)間重現(xiàn)是液相性能好壞的一個(gè)重要標(biāo)志，同一種東西，兩次的保留時(shí)間相差不要超過15 s，超過了半分鐘可看做保留時(shí)間漂移，就無法進(jìn)行定性，你要考慮以下原因：
1）溫控不當(dāng)。解決方法：調(diào)好柱溫，檢查是否有打開的窗戶或空調(diào)對(duì)著柱溫箱；
2）流動(dòng)相比例變化。解決方法：檢查四元泵的比例閥是否有故障；
3）色譜柱沒有平衡。解決方法：在每一次運(yùn)行之前給予足夠的時(shí)間平衡色譜柱；
4）流速變化。解決方法：重新設(shè)定流速 ；
5）泵中有氣泡。解決方法：從泵中除去氣泡 。

峰形異常問題
峰型問題是液相的主要問題，在做液相過程中，我們就是要變換不同的條件來改善不好的峰型，對(duì)于各種各樣的異常峰，要區(qū)別對(duì)待，從主要問題出發(fā)，一個(gè)一個(gè)加以解決。
1）色譜圖中未出峰。解決方法：系統(tǒng)未進(jìn)樣或樣品分解；泵未輸液或流動(dòng)相使用不正確；檢測(cè)器設(shè)置不正確；針對(duì)以上情況成因作相應(yīng)調(diào)整即可。
2）一個(gè)峰或幾個(gè)峰是負(fù)峰。解決方法：流動(dòng)相吸收本底高；進(jìn)樣過程中進(jìn)入空氣；樣品組分的吸收低于流動(dòng)相。
3）所有峰均為負(fù)峰。解決方法：信號(hào)電纜接反或檢測(cè)器輸出極性設(shè)置顛倒；光學(xué)裝置尚未達(dá)到平衡。
4）所有峰均為寬峰。解決方法：系統(tǒng)未達(dá)到平衡；溶解樣品的溶劑極性比流動(dòng)相差很多；色譜柱尺寸及類型選擇不正確；色譜柱或保護(hù)柱被污染或柱效降低；溫度變化造成的影響。
5）所出峰比預(yù)想的小。解決方法：樣品黏度過大；進(jìn)樣品故障或進(jìn)樣體積誤差；檢測(cè)器設(shè)置不正確；定量環(huán)體積不正確；檢測(cè)池污染；檢測(cè)器燈出現(xiàn)問題。
6）出現(xiàn)雙峰或肩峰。解決方法：進(jìn)樣量過大；樣品濃度過高；保護(hù)柱或色譜柱柱頭堵塞；保護(hù)拄或色譜柱污染或失效；柱塌陷或形成短通道。
7）前伸峰。解決方法：進(jìn)樣量或樣品濃度高；溶解樣品的溶劑較流動(dòng)相極性強(qiáng)；保護(hù)柱或色譜柱污染或失效。
8）拖尾峰。解決方法：柱超載，降低樣品量；增加柱直徑采用較高容量的固定相；峰干擾，對(duì)樣品進(jìn)行清潔過濾；調(diào)整流動(dòng)相；硅羥基作用，加入三乙胺，用堿致鈍化柱增加緩沖液或鹽的濃度降低流動(dòng)相pH值；柱內(nèi)燒結(jié)不銹鋼失效，更換燒結(jié)不銹鋼；加在線過濾器，對(duì)樣品進(jìn)行過濾；死體積或柱外體積過大，將連接點(diǎn)降至最低；盡可能使用內(nèi)徑較細(xì)的連接管；柱效下降，更換柱子；采用保護(hù)柱，對(duì)柱子進(jìn)行再生。
9）出現(xiàn)平頭峰。解決方法：檢測(cè)器設(shè)置不正確；進(jìn)樣體積太大或樣品濃度太高。
10）出現(xiàn)鬼峰。解決方法：進(jìn)樣閥殘余峰，在每次進(jìn)完樣后用充足的時(shí)間來平衡和清洗系統(tǒng)；樣品中存在未知物，改進(jìn)樣品的預(yù)處理；流動(dòng)相污染，更換新流動(dòng)相，盡可能現(xiàn)配現(xiàn)用，隔夜的流動(dòng)相再次使用時(shí)要過濾；盡可能使用HPLC級(jí)試劑；流路中有小的氣泡，打開Purge閥，加大流速排除。

以上內(nèi)容只是對(duì)液相色譜中出現(xiàn)的常見的問題進(jìn)行了分析，在故障排除時(shí)要遵守以下原則：（1）一次只改變一個(gè)因素，確定假定因素與問題之間的聯(lián)系；（2）如果通過更換組件來排查故障時(shí)要注意將拆下的完好組件裝回原位，避免浪費(fèi)；（3）養(yǎng)成良好的記錄習(xí)慣，這是成功進(jìn)行故障排除的關(guān)鍵。

總之，在使用高效液相色譜時(shí)一定要注意樣品的前處理與儀器的正確操作和保養(yǎng)。
在日常的使用過程中，儀器條件經(jīng)常變化，色譜柱經(jīng)常拆卸，因此需要對(duì)色譜儀經(jīng)常檢定以發(fā)現(xiàn)儀器性能的變化。但有不少實(shí)驗(yàn)人員因?yàn)椴皇煜�儀器的結(jié)構(gòu)原理，不甚了解儀器的技術(shù)指標(biāo)對(duì)分析測(cè)定結(jié)果的影響，而不能將儀器調(diào)整到最佳狀態(tài)，從而直接影響到所測(cè)定數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。

如果實(shí)驗(yàn)人員能注意檢定液相色譜儀的一些問題，則會(huì)大大延長(zhǎng)儀器的使用壽命，并使儀器的性能得到最大限度的發(fā)揮。下面，我們重點(diǎn)討論液相色譜儀檢定中常見的幾個(gè)影響因素以及解決問題的方法：

氣泡
由于HPLC系統(tǒng)中氣泡的存在，會(huì)造成色譜圖上出現(xiàn)尖銳的噪聲峰，嚴(yán)重時(shí)會(huì)造成分析靈敏度下降；氣泡變大進(jìn)入流路或色譜柱時(shí)會(huì)使流動(dòng)相的流速變慢或不穩(wěn)定，使基線起伏。

造成上述現(xiàn)象的主要原因有三條：一是流動(dòng)相溶液中往往因溶解有氧氣或混入了空氣而形成氣泡；二是系統(tǒng)開始工作時(shí)未能將流路中的空氣驅(qū)趕干凈；三是在注入樣品時(shí)不注意混入了空氣。

為了避免這類問題的出現(xiàn)，HPLC實(shí)際分析過程中必須重視對(duì)流動(dòng)相進(jìn)行脫氣處理；在HPLC系統(tǒng)開始工作前，可以用注射器連接恒流泵的排空閥，抽入流動(dòng)相，將流路中的空氣驅(qū)趕干凈；在注入樣品前注意排出樣品注射器中的空氣。

柱溫
在操作HPLC時(shí)，色譜柱是在室溫環(huán)境下工作的。大多數(shù)的工作環(huán)境溫度是不斷變化的，溫度的差別就會(huì)引起較復(fù)雜的問題。溫度的影響在所有的色譜分析方式中都是存在的，HPLC方法中的洗脫方式受溫度的影響。
1）等度洗脫時(shí)溫度會(huì)影響保留時(shí)間。當(dāng)溫度升高時(shí)所有的色譜峰都前移了，等度洗脫時(shí)一般溫度每升高1℃，保留時(shí)間會(huì)縮短（1~3）%。
2）溫度變化對(duì)梯度洗脫和等度洗脫的影響趨勢(shì)是一樣的，但是對(duì)梯度洗脫的影響要小于對(duì)等度洗脫的影響。即便如此，若梯度洗脫時(shí)不控制溫度的話，保留值一般也會(huì)有較大的變化。
3）溫度變化還可能引起選擇性顯著變化。
正如柱子不能完全平衡將導(dǎo)致保留時(shí)間的重現(xiàn)性差一樣，柱溫不平衡也會(huì)導(dǎo)致不理想的后果，這個(gè)問題在峰寬上的影響尤其明顯。當(dāng)溫度變化時(shí)除了選擇性和保留時(shí)間的變化之外，峰寬也會(huì)發(fā)生變化。升高溫度通常會(huì)使理論塔板數(shù)升高，峰寬變窄，由于峰面積不變，峰越窄就會(huì)越高，因此升高溫度可以達(dá)到更小的檢測(cè)限。
4）柱子里的溫度變化也會(huì)影響峰形。當(dāng)流動(dòng)相和柱子之間的溫差增大時(shí)，由溫度不平衡而導(dǎo)致的峰變形就會(huì)加劇。
為了獲得一致的結(jié)果我們必須要控制柱溫，使用柱溫箱是最好的辦法。如果沒有柱溫箱，最有效的辦法就是將色譜柱隔絕在一個(gè)溫度波動(dòng)最小的地方。

色譜柱污染
色譜柱污染會(huì)引起保留時(shí)間漂移。HPLC色譜柱是非常有效的吸附性過濾器，它可以過濾并吸附流動(dòng)相攜帶的任何物質(zhì)。污染源可能是：流動(dòng)相本身，流動(dòng)相容器，連接管、泵、進(jìn)樣器和儀器密封墊，以及樣品等。

樣品中如果存在色譜柱上保留很強(qiáng)的組分，就可能使保留時(shí)間漂移。通常樣品中的強(qiáng)保留組分具有較高的分子量，在此情況下，保留時(shí)間漂移的同時(shí)或其后會(huì)有反壓的增加�？梢酝ㄟ^使用固相提取等樣品前處理方法來去除樣品基質(zhì)的影響。

避免色譜柱污染最簡(jiǎn)單的方法是防患于未然。相比之下，找到問題的所在并設(shè)計(jì)有效的清洗步驟以去除污染物要困難的多。通常使用在給定色譜條件下的強(qiáng)溶劑，但并非所有污染物都可以在流動(dòng)相中溶解。使用保護(hù)柱是個(gè)非常有效的方法。反沖色譜柱僅是不得已時(shí)采用的辦法。

色譜柱平衡
如果我們觀察到保留時(shí)間漂移，首先應(yīng)考慮色譜柱是否已用流動(dòng)相完全平衡。通常平衡需要10~20個(gè)柱體積的流動(dòng)相。但如果在流動(dòng)相中加入少量添加劑則需要相當(dāng)長(zhǎng)的時(shí)間來平衡色譜柱。需要柱子的充分平衡，然后才能對(duì)HPLC進(jìn)行檢定。

流動(dòng)相有機(jī)溶劑
流動(dòng)相有機(jī)溶劑可能影響HPLC的檢測(cè)限。分析中要求使用HPLC純的試劑，關(guān)鍵是兩點(diǎn)：純度高、紫外吸收小。

純度高，是希望沒有雜質(zhì)干擾HPLC分析；不會(huì)有金屬離子損害純度為99.99%以上的高純度硅膠基質(zhì)。

可以通過重蒸分析純?nèi)軇�；或�(yàn)V膜過濾，并定期把前置的過濾頭取下，放稀硝酸里清洗，再用純水洗至中性。

柱壓
柱壓過高是HPLC分析中常碰到的問題。其原因有多方面，而且常常并不是柱子本身的問題。
1）溶劑或樣品含有顆粒雜質(zhì)，這些雜質(zhì)將篩板堵塞引起壓力上升，應(yīng)更換柱子入口篩板；
2）泵內(nèi)有空氣，解決的辦法是清除泵內(nèi)空氣，對(duì)溶劑進(jìn)行脫氣處理；
3）比例閥失效，應(yīng)更換比例閥；泵密封墊損壞，應(yīng)更換密封墊；系統(tǒng)檢漏，則找出漏點(diǎn)，密封即可。

HPLC分析中，在色譜柱正常，樣品靈敏度足夠，分析方法合適，色譜峰在出峰時(shí)間較短的條件下，峰形應(yīng)對(duì)稱而尖銳。充分考慮到可能影響分析結(jié)果的因素，可以科學(xué)地進(jìn)行液相色譜儀的檢定。