探究鱟試劑檢測(cè)法變異性與測(cè)試誤差的根源

一、介紹
鱟試劑（LAL）測(cè)定法是藥典中用于檢查藥品（如USP <85>章所述）、加工材料和藥用級(jí)水中細(xì)菌內(nèi)毒素的檢測(cè)方法。

對(duì)于任何生物測(cè)試，測(cè)試結(jié)果都容易受到分析條件變化的影響。在這里，鱟試劑測(cè)定法即使作為生物測(cè)定法，也具有相對(duì)較高的變異性^[1]。這種變化主要來自3個(gè)方面：試劑、產(chǎn)品和方法^[2]。本文以光度法（顯色法和比濁法）為重點(diǎn)，探討了造成鱟試劑檢測(cè)差異的一些原因，并研究了如何通過良好的實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制來評(píng)估差異。

二、鱟試劑測(cè)試的變異性
鱟試劑檢測(cè)的不同方面都會(huì)造成差異。這些方面包括鱟試劑、內(nèi)毒素對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)、標(biāo)準(zhǔn)曲線和稀釋誤差。我們將依次對(duì)這些方面進(jìn)行研究。

（一）鱟試劑
鱟試劑會(huì)導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果的差異，原因如下：
鱟試劑（鱟溶解物）來源于生物，是多種酶和輔助因子的復(fù)雜混合物。該提取物是相對(duì)粗糙的混合物，不是單一的純化酶，這意味著無法準(zhǔn)確測(cè)定每批裂解物的酶活性。

生產(chǎn)過程中會(huì)添加緩沖劑和洗滌劑，這也是造成差異的一個(gè)原因。

制造商使用美國藥典提供的參考標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素（RSE）對(duì)每批鱟試劑的酶活性進(jìn)行評(píng)估，通過進(jìn)行2倍稀釋系列來評(píng)估鱟試劑的靈敏度。用于表征裂解液的RSE因其稀有性和昂貴性，并非所有檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室都能輕易獲得，所以實(shí)驗(yàn)室通常使用細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品（CSE）。CSE的效力由鱟試劑供應(yīng)商根據(jù)RSE評(píng)估CSE來確定。這就增加了測(cè)試差異的可能性。

（二）細(xì)菌內(nèi)毒素
檢測(cè)中使用的內(nèi)毒素會(huì)導(dǎo)致差異，這是因?yàn)椋?/span>
實(shí)驗(yàn)室中用于制備細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品（CSE）的內(nèi)毒素來自純化的大腸桿菌菌株。CSE是一種高度純化的脂多糖，不含大多數(shù)可檢測(cè)的污染物（如蛋白質(zhì)）。CSE含有額外的穩(wěn)定填充劑，如淀粉、人血清白蛋白和聚乙二醇。然而，環(huán)境內(nèi)毒素未經(jīng)純化，通常以脂多糖、細(xì)胞膜蛋白和磷脂的大分子復(fù)合物的形式存在，這些物質(zhì)由革蘭氏陰性細(xì)菌在生長和死亡過程中脫落。因此，根據(jù)純化內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定環(huán)境內(nèi)毒素時(shí)存在差異^[3]。

此外，盡管鱟試劑檢測(cè)對(duì)內(nèi)毒素具有特異性，但它只能檢測(cè)內(nèi)毒素分子中可用于激活裂解物的脂質(zhì)A部分（凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)的激活，因子C通路，如下所述）^[4]。內(nèi)毒素分子的脂質(zhì)A部分可能形成未完全分散的聚集體，因此不夠均勻，無法進(jìn)行準(zhǔn)確的總測(cè)量。

因此，檢測(cè)到內(nèi)毒素的樣品不一定能顯示出樣品中的所有內(nèi)毒素，因?yàn)檫@取決于脂質(zhì)A的含量，所以檢測(cè)到內(nèi)毒素的樣品可能會(huì)被低估。此外，檢測(cè)到內(nèi)毒素的樣本在重復(fù)檢測(cè)時(shí)可能不會(huì)顯示出相同水平的內(nèi)毒素，因?yàn)殡S著時(shí)間的推移，樣本的化學(xué)性質(zhì)和穩(wěn)定性會(huì)發(fā)生變化，脂質(zhì)A的可用性也會(huì)隨之改變。還應(yīng)注意的是，不同類型的環(huán)境內(nèi)毒素的毒性和反應(yīng)性有所不同，這取決于脂質(zhì)A分子對(duì)不同細(xì)菌種類的生物活性。

（三）鱟試劑檢測(cè)法的變異性
鱟試劑檢測(cè)法固有的變異性為50%至200%（或每個(gè)內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)兩側(cè)各有一個(gè)2倍誤差）。對(duì)于動(dòng)力學(xué)測(cè)定法，變異性源于內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率^[5]。

檢測(cè)變化可能來自一系列測(cè)試輸入，包括：
●試管
●一次性移液器吸頭
●微量移液器吸頭

針對(duì)上述情況，BET測(cè)試中使用的塑料（例如微量滴定板、塑料稀釋管）通常不是專門為內(nèi)毒素檢測(cè)而制造的。
●無菌技術(shù)
●分析技術(shù)
●移液方法的差異
●制備控制標(biāo)準(zhǔn)品的差異
●稀釋液配制過程中的變化（如果錯(cuò)誤發(fā)生在系列中的第一個(gè)稀釋中，則差異會(huì)放大）

長期儲(chǔ)存的稀釋液會(huì)發(fā)生變化�？勺円蛩匕�括溫度、容器成分、稀釋范圍和稀釋體積）。
●交叉污染
●產(chǎn)品或樣品干擾
●取樣容器
●樣品儲(chǔ)存時(shí)間和溫度
●LAL儀器/模塊變化——不同的儀器可能會(huì)產(chǎn)生不同的結(jié)果
●產(chǎn)品中存在內(nèi)毒素（內(nèi)毒素分子表現(xiàn)不同或脂質(zhì)A的可用性不同）
●添加緩沖液以穩(wěn)定pH值

輔助溶液可能不含內(nèi)毒素。

上述某些問題與檢測(cè)技術(shù)人員的操作直接相關(guān)（如稀釋液的配制、移液、原材料的稱重和無菌技術(shù)等）。

（四）內(nèi)毒素濃度
隨著標(biāo)準(zhǔn)系列使用的內(nèi)毒素濃度變小，誤差的顯著性也會(huì)增加。例如，標(biāo)準(zhǔn)曲線為1.0至0.1 EU/mL時(shí)，50%至200%的誤差將比5.0至0.005 EU/mL的標(biāo)準(zhǔn)系列產(chǎn)生的影響較小，這是因?yàn)闃?biāo)準(zhǔn)系列中最后一個(gè)內(nèi)毒素濃度值較小。也許正是由于這些原因，藥典中列出的測(cè)試對(duì)照品的可接受加標(biāo)回收率為50%至200%。

（五）稀釋誤差
測(cè)試稀釋時(shí)可能會(huì)出現(xiàn)錯(cuò)誤，特別是在稀釋內(nèi)毒素和繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)。為避免在繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)出現(xiàn)稀釋誤差，建議采取以下控制措施：

每批內(nèi)毒素或裂解物在常規(guī)使用前，應(yīng)由3名技術(shù)人員對(duì)稀釋系列進(jìn)行鑒定，每次對(duì)稀釋系列進(jìn)行3次驗(yàn)證。每個(gè)接受過該試驗(yàn)培訓(xùn)的新技術(shù)人員都要進(jìn)行類似的操作。

對(duì)于常規(guī)檢測(cè)，不同試驗(yàn)的稀釋順序不應(yīng)有差異（即，始終進(jìn)行相同類型的稀釋）。

內(nèi)毒素的起始濃度應(yīng)始終保持相同（通常為1000EU/mL）。內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)曲線是根據(jù)相同的內(nèi)毒素起始濃度（1000EU/mL）繪制的。這一點(diǎn)可通過查看生產(chǎn)商的分析證書進(jìn)行驗(yàn)證，也可通過比較使用中的對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素和參考標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素（均為大腸桿菌O113:H10的純化提取物）對(duì)生產(chǎn)商的證書進(jìn)行確認(rèn)測(cè)試。

盡管如此，在上述情況下，如果進(jìn)行測(cè)試的技術(shù)人員出了差錯(cuò)，仍有可能發(fā)生稀釋錯(cuò)誤。

（六）標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系
標(biāo)準(zhǔn)曲線的一致性是鱟試劑檢測(cè)的一個(gè)重要特征。線性標(biāo)準(zhǔn)曲線的y軸截距僅發(fā)生1%的變化，就會(huì)導(dǎo)致內(nèi)毒素測(cè)定值發(fā)生30%至35%的變化。因此，已知10EU/mL的樣品可能讀數(shù)為13.5EU/mL，這并不是因?yàn)闃悠分械膬?nèi)毒素含量發(fā)生了變化，而是因?yàn)閥-截距發(fā)生了變化�？刂茲岫确�鱟試劑檢測(cè)變異性的一個(gè)重要方法是密切關(guān)注起始（反應(yīng)）時(shí)間。這些起始時(shí)間看似微小的變化都會(huì)導(dǎo)致線性、斜率和y軸截距的變化，從而對(duì)檢測(cè)結(jié)果產(chǎn)生重大影響^[6]。

三、評(píng)估差異
雖然可以采取措施減少變異，但根據(jù)良好質(zhì)量控制的原則，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)該有監(jiān)督和評(píng)估的手段，以確定檢測(cè)結(jié)果是否令人滿意，以及變異是否過大到足以引起關(guān)注的程度。其中一種方法就是審查變異系數(shù)（CV）。

（一）變異系數(shù)的應(yīng)用
變異系數(shù)是精確度的衡量標(biāo)準(zhǔn)。分析程序的精確度是指單個(gè)檢測(cè)結(jié)果之間的一致程度（或者，用檢測(cè)術(shù)語來說，是指當(dāng)分析程序重復(fù)應(yīng)用于單一、同體積生物基質(zhì)的多個(gè)等分試樣時(shí)，單個(gè)分析物測(cè)量結(jié)果的接近程度）^[7]。變異系數(shù)是以平均值的百分比表示的標(biāo)準(zhǔn)差。當(dāng)不同樣本之間的平均值增加時(shí)，變異系數(shù)值就可以用來測(cè)量變異性。

通常，變異系數(shù)表示為測(cè)試重復(fù)之間的百分比（%CV）。這可以應(yīng)用于標(biāo)準(zhǔn)曲線點(diǎn)和測(cè)試樣品復(fù)制。對(duì)于鱟試劑，常見的要求是CV≤10%或≤25%（取決于裂解物供應(yīng)商設(shè)定的要求）。百分比變異系數(shù)越低，說明不同測(cè)試副本之間的精確度越接近（與平均值的“散差”相對(duì)較�。�。

計(jì)算CV有不同的方法。這些方法與計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)差的不同方法有關(guān)。一旦采用了標(biāo)準(zhǔn)差的計(jì)算方法，CV就可以表示為標(biāo)準(zhǔn)差與平均值之間的比率。

由此，可以計(jì)算出%CV值：
100% ×（標(biāo)準(zhǔn)差/算術(shù)平均數(shù)）

從上式可以看出，CV轉(zhuǎn)換為百分比的方法是將得到的數(shù)字乘以100，得出%CV值^[8]。

在評(píng)估鱟試劑檢測(cè)時(shí)，根據(jù)EU/mL的測(cè)量值計(jì)算出的%CV值通常會(huì)隨著內(nèi)毒素濃度的降低而增加，因?yàn)檩^高濃度的內(nèi)毒素通�？色@得<10%的值，而較低濃度的內(nèi)毒素（通常接近標(biāo)準(zhǔn)曲線的末端并接近檢測(cè)限）可獲得10%到30%的值。

在此需要指出的是，不同的鱟試劑供應(yīng)商對(duì)鱟試劑檢測(cè)有不同的驗(yàn)收標(biāo)準(zhǔn)，并通過軟件包以不同的方式計(jì)算其%CV值。例如，有些供應(yīng)商根據(jù)以每毫升內(nèi)毒素單位（EU/ mL）表示的結(jié)果來計(jì)算變異系數(shù)；而有些供應(yīng)商則根據(jù)樣品的起始時(shí)間（以毫吸光為單位）來計(jì)算變異系數(shù)^[9,10]。

（二）檢測(cè)稀釋錯(cuò)誤
除變異系數(shù)外，稀釋誤差也需要評(píng)估。為了檢查鱟試劑檢測(cè)是否正確，應(yīng)檢查標(biāo)準(zhǔn)曲線上內(nèi)毒素濃度最高點(diǎn)的反應(yīng)時(shí)間，確保其在以秒為單位的預(yù)期時(shí)間范圍內(nèi)。這一點(diǎn)非常重要，因?yàn)檫@些起始時(shí)間看似微小的變化會(huì)導(dǎo)致線性度、斜率和Y-截距的變化，從而對(duì)測(cè)試結(jié)果產(chǎn)生重大影響^[11]。

為此，需要檢查起始內(nèi)毒素濃度的起始時(shí)間（如5.0 EU/ml）。這需要對(duì)歷史數(shù)據(jù)進(jìn)行研究，以確定典型范圍。為了提高準(zhǔn)確性，建議對(duì)使用內(nèi)毒素進(jìn)行的前100次測(cè)試進(jìn)行評(píng)估。如果稀釋液的制備出現(xiàn)錯(cuò)誤，那么起始時(shí)間將超出預(yù)期范圍。

檢測(cè)起始時(shí)間是檢測(cè)誤差的一個(gè)重要指標(biāo)，因?yàn)樗�直接關(guān)系到光度法LAL檢測(cè)方法的工作方式。采用動(dòng)態(tài)濁度法或顯色法進(jìn)行LAL檢測(cè)時(shí)，裂解液（等分到反應(yīng)管中）會(huì)與等分樣品或標(biāo)準(zhǔn)曲線稀釋液中的任何內(nèi)毒素發(fā)生反應(yīng)^[12]。所發(fā)生的反應(yīng)是根據(jù)時(shí)間測(cè)量濁度或顏色的變化。達(dá)到濁度閾值（在預(yù)先設(shè)定的光學(xué)范圍內(nèi)以毫吸光度單位測(cè)量）的時(shí)間越快，內(nèi)毒素濃度就越高。這一起始時(shí)間范圍不僅因內(nèi)毒素水平而異，而且不同批次的裂解液和對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素也會(huì)有所不同。

起始時(shí)間必須在正確的范圍內(nèi)，因?yàn)樗�可以確定已進(jìn)行了正確的稀釋。舉例來說，如果測(cè)試的稀釋方法不正確，相關(guān)系數(shù)和報(bào)告的內(nèi)毒素值看起來仍然是正確的。這是因?yàn)橄嚓P(guān)系數(shù)是實(shí)際值與預(yù)期值之間的最佳擬合線，而軟件會(huì)解釋這些數(shù)據(jù)，并通過從標(biāo)準(zhǔn)系列中推斷出估計(jì)的內(nèi)毒素濃度^[13]。

根據(jù)平均值的第二個(gè)標(biāo)準(zhǔn)偏差，可以計(jì)算出起始濃度的光密度達(dá)到所需閾值所需的時(shí)間范圍。 鑒于LAL檢驗(yàn)本身存在誤差（通常認(rèn)為誤差為±25%），為了與其他生物檢驗(yàn)方法保持一定程度的標(biāo)準(zhǔn)化，第二個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差可以說是最合適的測(cè)量方法。標(biāo)準(zhǔn)差是衡量單個(gè)元素偏離平均值（均值）的程度。其計(jì)算公式為方差的平方根（如圖1所示）。
 

使用平均值的2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差表明95%的值落在上下限范圍內(nèi)。除此之外的5%代表非典型值。

每次LAL檢驗(yàn)完成后，記錄最高內(nèi)毒素濃度（曲線起點(diǎn)）的起始時(shí)間都要與這一范圍進(jìn)行比較，只有當(dāng)測(cè)得的起始時(shí)間在這一范圍內(nèi)時(shí)，才可認(rèn)為檢驗(yàn)是合格的。如果出現(xiàn)稀釋錯(cuò)誤，那么起始時(shí)間就會(huì)超出預(yù)期的時(shí)間范圍。

通過采用平均值的2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差，任何超出計(jì)算范圍的測(cè)試值都被視為非典型值，不能代表正常人群。因此，需要對(duì)LAL測(cè)試進(jìn)行調(diào)查。作為進(jìn)一步檢查技術(shù)員工作表現(xiàn)的一種方法，區(qū)域主管可對(duì)每位技術(shù)員標(biāo)準(zhǔn)曲線的起始時(shí)間進(jìn)行趨勢(shì)分析和檢查。

（三）標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)
還可以對(duì)標(biāo)準(zhǔn)系列的線性度進(jìn)行額外的檢查。為此，應(yīng)檢查每次測(cè)試的標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)（要求相關(guān)系數(shù)大于或等于0.980）。藥典要求每次測(cè)試都要進(jìn)行這項(xiàng)檢查。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的一致性是LAL檢驗(yàn)的一個(gè)重要特點(diǎn)。線性標(biāo)準(zhǔn)曲線的Y-截距只要變化 1%，就會(huì)導(dǎo)致內(nèi)毒素測(cè)定結(jié)果變化30%至35%。因此，已知為10 EU/mL的樣品，讀數(shù)可能為13.5 EU/mL——這不是因?yàn)闃悠分械膬?nèi)毒素含量發(fā)生了變化，而是因?yàn)閥-截距發(fā)生了變化^[6]。

（四）陰性對(duì)照
每次檢測(cè)都應(yīng)進(jìn)行陰性對(duì)照。陰性對(duì)照是用于構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線的水樣。陰性對(duì)照樣品可顯示在制備內(nèi)毒素系列時(shí)是否發(fā)生了污染。對(duì)照組的內(nèi)毒素含量必須低于標(biāo)準(zhǔn)曲線中的最低內(nèi)毒素濃度（常規(guī)標(biāo)準(zhǔn)系列為0.05EU/mL）。這項(xiàng)檢查是藥典要求的。

四、總結(jié)
本文探討了影響 LAL 檢測(cè)的一些變化來源。對(duì)于實(shí)驗(yàn)室用戶來說，了解這些因素非常重要，尤其是在設(shè)計(jì)檢測(cè)方法和調(diào)查檢測(cè)異常時(shí)。文章還考慮了一個(gè)衡量變異性的關(guān)鍵指標(biāo)：變異系數(shù)。這是實(shí)驗(yàn)室主管在審查測(cè)試結(jié)果時(shí)需要進(jìn)行的一項(xiàng)重要檢查。

參考文獻(xiàn)
1、Williams KL. Endotoxins, Pyrogens, LAL Testing and Depyrogenation, 2nd edition, CRC Press: Boca Raton. 2007.

2、McCullough KC and Weider-Loeven, C.: ‘Variability in the LAL Test: Comparison of Three Kinetic Methods for the Testing of Pharmaceutical Products’, Journal of Parenteral Science and Technology. 1992;44:69-72.

3、Brandberg K, et al. : Conformation of lipid A. the endotoxic center of bacterial lipopolysaccharide. Journal of Endotoxin Research. 1996;3:173-178.

4、Moser K. Playing Hide and Seek with Endotoxin, LAL User Group Newsletter.2009;3(2),1-5.

5、Kumar H. ‘Variability in the Bacterial Endotoxin Test or LAL Test’, Endosafe Times, Charles River Laboratories, USA. 2007.

6、McCullough K. (2008): Laboratory Variability, LAL Users’ Group Newsletter. 2008;2(3): 6-7.

7、Brosnahan K. “Understanding Correlation Coefficients and Coefficients of Variation in Photometric LAL Testing”, LAL Update. 2006;23(2):3-5.

8、Richardson K. and Novitsky, T.J. ‘Simple Statistics for the LAL User – Standard Deviation, Repeatability, Reproducibility and a Clarification of the Coefficient of Variation’, LAL Update. 2002:20(4).

9、Lindsay GK, Roslansky PF, Novitsky TJ (1989).S ingle-step, chromogenic Limulus amebocyte lysate assay for endotoxin, J Clin Microbiol. 1989;27(5): 947–951.

10、Górny RL, Douwes J, Versloot P, Heederik D, Dutkiewicz J. Application of the classic Limulus Test and the Quantitatibe Kinetic Chromogenic Method for Evaluation of Endotoxin Concentration in indoor air. Ann Agric Environ Med. 1999; 6:45-51.

11、Tsuchiya M. “Biases in the Bacterial Endotoxin Test”, BioProcess International Industry Year Book 2010-2011:144-145.

12、Guy D. “Endotoxins and Depyrogenation” in Hodges N. and Hanlon G. Industrial Pharmaceutical Microbiology: Standards and Controls. Euromed, 2003:12.1–12.15.

13、McCullough K. ‘Back to Basics: Where Did My Standard Curve Come From?’, LAL User Group Newsletter. 2009:3(2):6-8.