單細胞注射核心技術(shù)助力CHO克隆細胞系構(gòu)建

 

【背景概述】

CHO細胞（Chinese Hamster Ovary cells）是一種來自中國倉鼠卵巢的細胞系，與其他表達系統(tǒng)相比具有高蛋白產(chǎn)量、抵抗許多人類病毒感染、適合大規(guī)模工業(yè)培養(yǎng)等優(yōu)勢。早期研究表明，非糖基化版本的Avelumab(一種FDA批準的抗PD-L1抗體)在體內(nèi)表現(xiàn)出增強的抗腫瘤活性。因此，創(chuàng)建一個敲除非人類糖基化途徑相關基因的CHO細胞系具有非常高的商業(yè)利益。但在商業(yè)生產(chǎn)中為確保藥品的同質(zhì)性，監(jiān)管機構(gòu)要求CHO細胞必須是單細胞來源的。目前，單克隆細胞系的標準方法需要更長的時間線和費力的工作流程等問題。本文作者團隊提出了基因編輯的創(chuàng)新方法，一種結(jié)合CRISPR/Cas9和多功能單細胞顯微操作技術(shù)- FluidFM的單細胞核內(nèi)納米注射的方法，以解決當前轉(zhuǎn)染方法的一些缺點。FluidFM技術(shù)保證了單克隆性的起源為單個細胞，而且避免了繁瑣費時的有限稀釋法、復雜的單細胞分選技術(shù)。此外，該方法兼容于在CHO細胞中開發(fā)單個敲除克隆或者多個敲除克隆(FUT8、BAX和DHFR)。對單個和多個敲除克隆的進一步分析證實了靶向基因破壞和蛋白質(zhì)表達改變。敲除的CHO-K1克隆在隨后的傳代中表現(xiàn)出基因編輯的持久性，與無血清化學定義的培養(yǎng)基兼容，并表現(xiàn)出與親本克隆相同的轉(zhuǎn)基因表達。此外，F(xiàn)luidFM的力學控制特性避免了傳統(tǒng)電穿孔后觀察到的高細胞毒性，尤其是在難以轉(zhuǎn)染的細胞系中也是有效的。

圖1. FluidFM單細胞注射技術(shù)基因編輯示意圖

【實驗方法】

單細胞顯微操作系統(tǒng)FluidFM OMNIUM納米注射構(gòu)建單克隆敲除CHO-K1細胞系

第0天，使用多功能單細胞顯微操作系統(tǒng)-FluidFM OMNIUM將單個 CHO-K1細胞接種到孔板中心，并記錄單克隆性(圖2A)。第1天，使用FluidFM OMNIUM單細胞顯微操作系統(tǒng)將含有靶向的FUT8、BAX和DHFR的gRNA/Cas9 RNP復合物(20 ng µl⁻¹)注射到單細胞細胞核中(圖2B)。12. 5%的gRNA用Atto550標記以監(jiān)測注射效率。注射24小時后，依舊使用FluidFM OMNIUM單細胞顯微操作系統(tǒng)對細胞進行成像，通過GFP熒光成像檢測注射效率和存活率(圖2C)。將注射后的細胞在37℃，5% CO₂(v/v)的細胞培養(yǎng)箱環(huán)境中進行細胞培養(yǎng)，并監(jiān)測細胞生長和克隆擴增情況(圖 2D)。14天后，收集克隆，建立生物庫(圖2E & 2F)。同時，通過從目標位點擴增的PCR片段的Sanger測序?qū)�克隆進行分析。通過western blot (WB)在蛋白水平上驗證了編輯的有效性。

圖2.  (A)將單細胞接種在12孔板的中心，并記錄單克隆性。(B)接種細胞12-24小時后，細胞核內(nèi)同時注射Atto550標記的RNP靶向BAX、DHER或FUT8或所有三個基因和GFPmRNA。注入成功與否由核Atto550信號監(jiān)測。(C) ) 注射24 h后注射效率和細胞存活率進行明場（左）和GFP熒光（右）監(jiān)測。(D)在10-12天的過程中，通過明場成像記錄的克隆擴增情況。

【結(jié)果展示】

在本研究中，作者選擇了三個已建立的基因靶點(FUT8、BAX 和DHFR)，利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)進行基因工程，這與改善 CHO表達系統(tǒng)直接相關。早期的研究表明，與其他基因編輯技術(shù)相比，CRISPR/Cas9系統(tǒng)是在元代細胞和傳代細胞中誘導所需基因修飾的強大工具。

接下來的目標是得到含有FUT8、BAX和DHFR的單一KO單克隆CHO-K1細胞系或者含有這三種KO的多重KO指定的目標。為了確保重組生物制劑的同質(zhì)性，F(xiàn)DA當局要求使用來自單一克隆的CHO細胞進行生產(chǎn)。穩(wěn)定的單克隆細胞系的開發(fā)主要是通過繁瑣復雜的工作流程進行的，如有限稀釋、 克隆細胞挑選、細胞分選或陽性選擇。此外，這一過程需要更長的時間(>10周)、大工作量的克隆篩選和較低的成功率。為了克服這些限制，本文利用CRISPR/Cas9結(jié)合FluidFM OMNIUM單細胞顯微操作系統(tǒng)來加速基因工程單克隆CHO細胞系的產(chǎn)生。

本文方法從單個細胞開始，可以將CRISPR組分直接遞送到單個CHO-K1細胞的細胞核中(圖2)。與傳統(tǒng)轉(zhuǎn)染方法相比，該方法的主要優(yōu)點包括溫和地遞送，對遞送到細胞的RNP的比例和定量開創(chuàng)性的具有可控性。這將最大限度地實現(xiàn)靶上編輯，并實現(xiàn)多重編輯。此外，通過從單個細胞開始流程，確保了FDA要求的“單細胞性”。

本文研究小組使用單細胞顯微操作系統(tǒng)FluidFM OMNIUM將靶向FUT8、BAX和DHFR的gRNA/Cas9 RNP復合物注入單細胞中，并直達細胞核。產(chǎn)生單個KO或多個KO。細胞的單克隆性通過孔掃描和成像得到驗證(圖3A)。注射后第14天的遺傳分析顯示，使用 FluidFM單細胞顯微操作系統(tǒng)的工作流程，作者獲得了三個目標基因KO的克隆，以及7個、2個和1個分別缺失BAX、DHFR和FUT8的克隆。通過將Sanger與基因組靶位點比對來分析編輯結(jié)果(圖3A，單KO和圖3B 3KO 實驗)。然后，又對選擇的單克隆進行蛋白質(zhì)分析，在蛋白質(zhì)水平上驗證KO，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)克隆與遺傳數(shù)據(jù)一致(圖3C)。

圖3. FUT8、BAX和DHFR敲除后的單克隆CHO-K1細胞系的發(fā)育。 (A)野生型對照(Wt)和基因編輯的CHO-K1細胞系單敲除(KO)與FUT8(上)、 BAX(中)和DHFR(下)基因組序列的Sanger測序比對的代表性圖像。 (B)野生型對照(Wt)和基因編輯的CHO-K1細胞系的Sanger測序比對圖像， 多重敲除(KO) FUT8(上)、 BAX(中)和DHFR(下)的基因組序列。 (C) Western blot顯示所選克隆的FUT8(左)、 BAX(中)和DHFR(右)檢測。 以GAPDH作為上樣對照。 (D) DsRed在親本野生型CHO-K1和多個KO CHO-K1單克隆細胞系中與未轉(zhuǎn)染的野生型CHO-K1細胞的表達分析。

 

除了內(nèi)源性靶基因(FUT8、BAX和DHFR)表達外，所有生成的基因KO克隆(單個或多個)都表現(xiàn)出與WT CHOK1細胞相似的細胞生長水平和微觀形態(tài)。為了確保基因組工程細胞仍然適合作為表達宿主，用DsRed mRNA轉(zhuǎn)染3x KO CHO-K1單克隆細胞系。隨后流式細胞術(shù)比較轉(zhuǎn)染細胞的DsRed表達水平與親代野生型CHO-K1無明顯差異(圖3D)。而后，通過FluidFM的方法獲得的敲除CHO-K1單克隆細胞系傳代2-5次，并通過桑格測序/ICE分析證實了基因編輯的持久性。

隨后，作者用三個獨立的注射輪重復了CHO三重KO實驗，并評估了24小時后的細胞存活率。數(shù)據(jù)顯示，24小時后的存活率為81% +/−11%，這表明FluidFM納米注射技術(shù)本身沒有細胞毒性，且約50%的注射細胞在第7天成功克隆，KO基因型成功率> 30% 。作者還通過將實驗獲得的的FUT8 KO、 BAX KO和Triple KO CHO-K1細胞暴露于無血清化學定義培養(yǎng)基(CDM)中，逐步降低血清狀態(tài)，評估了該方法的行業(yè)相關性。親代CHO細胞和基因編輯細胞都不受無血清條件的影響，并證明了該方案策略的工業(yè)試驗適用性。作者還檢測了CHO-WT、CHO-FUT8 KO、CHO-BAX KO和CHO-Triple KO細胞在CDM 中mRNA轉(zhuǎn)基因表達的表達水平。得到CHO-WT和用FluidFM納米注射產(chǎn)生的所有三種不同的KO細胞都顯示出相同的表達水平(95%-98% of DsRed+細胞)。綜上所述，使用FluidFM進行基因組工程不會損害編輯后的CHO-K1細胞的一般細胞特征和功能。此外，該技術(shù)有擴展到其他細胞系的可能性，進而實現(xiàn)制造其他藥物的高效模式，如疫苗等。

 

【討論與展望】

隨著CRISPR等基因編輯技術(shù)的發(fā)展，多位點編輯的越來越引起了研究者的重視。傳統(tǒng)的細胞系構(gòu)建實驗中，為了得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞系，候選細胞系在增殖過程中被反復評估。目前需要的時間是12到14周。相比之下，通過FluidFM OMNIUM技術(shù)可以挑選單個注射編輯過的單個細胞，并從中產(chǎn)生克隆體——從轉(zhuǎn)染之日起直到克隆體被鑒定出來，不到三周的時間。大大提高了細胞系構(gòu)建的時間。

圖4. 多功能單細胞顯微操作系統(tǒng)FluidFM OMNIUM

 

FluidFM OMNIUM單細胞顯微操作系統(tǒng)為單細胞基因工程領域帶來了全新的突破，可以快速且有效地開發(fā)單克隆細胞系。傳統(tǒng)的方法適用于很常見的細胞系和基因工程策略，但當處理不常見、罕見的或脆弱的和已知難以轉(zhuǎn)染的原代細胞類型，或者需要復雜的實驗設計時（例如CRISPR多基因編輯），傳統(tǒng)的方案就非常受限制。在這些特殊情況下，F(xiàn)luidFM OMNIUM技術(shù)是少有可用的解決方案。

另外，無論您使用原代細胞、干細胞，神經(jīng)元還是任何其他已知難以轉(zhuǎn)染的細胞類型，F(xiàn)luidFM OMNIUM單細胞顯微操作系統(tǒng)都可以可靠且輕松地遞送任何類型的可溶性化合物。

 

圖5. 使用FluidFM注射編碼GFP的質(zhì)粒24小時后表達GFP的神經(jīng)元(由暨南大學閆森提供，中國廣州)。

 

圖6. 紅色熒光顯示右旋糖酐注射后在C57BL/6 C57小鼠海馬神經(jīng)元內(nèi)擴散(由北京大學孫玉杰提供，中國北京)。

 

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