微載體相關工藝的特點

隨著各種病毒的流行和爆發(fā)，人們需要更多的人用和獸用病毒性疫苗的研發(fā)和生產。
 
疫苗的高產能需要大規(guī)模的細胞培養(yǎng)，而大規(guī)模貼壁細胞的培養(yǎng)生長必須有可以貼附的支持物表面，細胞依靠自身分泌的或培養(yǎng)基中提供的貼附因子才能在該表面上生長，繁殖。
 
貼壁細胞對于放大是一個挑戰(zhàn)，傳統(tǒng)使用的轉瓶，細胞工廠等，耗材用量高，占地面積大，培養(yǎng)成本高，而隨著新科技的發(fā)展微載體技術已經越來越成熟，現(xiàn)在微載體在一次性反應器的應用也比較成熟，在新建藥品生產產線中一次性反應器的選擇越來越多。
 
一次性反應器生產可控性更高、效率更高、靈活；可省去傳統(tǒng)不銹鋼生物反應器所需的清潔驗證工作，同時隨著灌流等上游技術的完善，生物制藥的生產逐步朝著更小的上游培養(yǎng)規(guī)模和更大的下游純化規(guī)模的方向發(fā)展，一次性在灌流相關的應用也更加智能化。
 
世界范圍內的許多國家的絕大多數(shù)減毒或滅活疫苗類型的人用和獸用疫苗都在使用微載體進行生產。

基于微載體生產的疫苗包括：
脊髓灰質炎病毒（Poliovirus）、麻疹病毒（Measles virus）、狂犬病病毒（Rabies virus）、流感病毒（Influenza virus）、日本乙型腦炎疫苗（JEV）、埃博拉病毒（ZEBOV）、新冠病毒（SARS-CoV2）、和口蹄疫病毒（FMDV）等疫苗。
 
同時，還有利用微載體生產的很多在研的病毒性疫苗，如基孔肯尼亞病毒（Chikungunya virus）、登革熱病毒（Dengue fever virus）、手足口病（EV71）、漢坦病毒（Hantaan virus）、西尼羅病毒（West Nile virus）、呼吸道合胞體病毒（RSV）和黃病毒（Yellow fever virus）等病毒性疫苗。與其他細胞培養(yǎng)工藝相比，微載體培養(yǎng)工藝可以提高產量，降低成本，并減少污染^[1]。

另外，微載體培養(yǎng)技術在獸用疫苗研制中也有廣泛應用：
如豬瘟（CSFV）、豬偽狂犬�。≒RV）、豬細小病毒（PPV）、犬瘟熱病毒疫苗（CDV）、豬流行性腹瀉病毒（PEDV）和豬圓環(huán)病毒（PCV2）等病毒性疫苗。

  球狀微載體是指直徑在60-250μm，適用于貼壁細胞生長的微球。自Van Wezel等人在1967年用DEAE-Sephadex A-50研制出第一種微載體以來，經過市場中半個多世紀的應用和優(yōu)化，目前微載體已經廣泛應用于疫苗、單克隆抗體、重組蛋白、細胞治療、干細胞培養(yǎng)、原代細胞培養(yǎng)擴增、細胞肉、組織再生和藥物遞送等多個生物醫(yī)藥領域。
   1. 表面電荷：
通常情況下，微面帶正電荷，電荷的密度是影響細胞生長的一個關鍵因素。微載體的電荷密度控制在1-2 meq/g范圍內，若低于1meq/g，會導致細胞吸附不充分或不吸附的情況，但電荷密度過大，則會產生“毒性”效應或抑制細胞生長。

2. 直徑大�。�
微載體的直徑一般不低于50-70nm，直徑太小會抑制細胞在微載體上的生長。一般情況下，微載體直徑控制在100-250nm范圍內比較適宜。同時，也要最小化微載體直徑均勻一度的差異，以保證收獲細胞的時間和密度的一致性。

3. 密度：
微載體的密度要比培養(yǎng)基密度略大一些，以便與培養(yǎng)基分離，但也不能太大，要保證在低轉速時可以懸浮起來，以免高轉速產生的剪切力損傷細胞，所以微載體的密度一般為1.03-1.05g/mL。

4. 接種密度：
細胞接種密度跟細胞類型、微載體用量和培養(yǎng)條件等有很大關系，通常情況下，微載體用量在3-20g/L范圍。根據(jù)細胞類型和培養(yǎng)情況，每個小球細胞接種量在10-50個細胞，細胞最終可擴增3-10倍。

目前，微載體培養(yǎng)技術主要應用在病毒性疫苗生產中，有很多種類的病毒疫苗生產都達到了1000-6000L的規(guī)模，且還有很多在研的新型病毒疫苗利用微載體技術進行放大培養(yǎng)。
 
微載體培養(yǎng)技術在病毒性疫苗領域的應用得益于Vero細胞的發(fā)展和應用。Vero 細胞系是第一個被 WHO 批準用于生產人用病毒疫苗的連續(xù)細胞系 (CCL) ，Vero 細胞作為人類疫苗基質已有 30 多年的經驗，在全球生產和銷售了數(shù)億劑疫苗^[1]。由于Vero細胞是干擾素表達缺陷型細胞，固有免疫反應較弱，因此它對多種病毒易感，且易產生高滴度的病毒。
 
因此，Vero細胞在病毒性疫苗行業(yè)的應用地位如同CHO在抗體領域的地位一樣重要。另外，微載體還適合其他多種貼壁細胞的生長，如MDCK、MARC-145、BHK-21和PK-15等，這些細胞在各種類型病毒性疫苗的生產中起著重要作用。

   
Puredex^® Cyto-1是一類基于交聯(lián)葡聚糖基架,帶有正電荷基團的微載體，它可以為細胞提供廣闊的附著面，從而提高細胞密度，實現(xiàn)高產的目的。Puredex^® Cyto-1微載體不僅為貼壁細胞改變培養(yǎng)方式提供了可能，更方便優(yōu)化細胞培養(yǎng)工藝，實現(xiàn)降本增效的目的。Puredex^® Cyto-1微載體可以用于多種宿主細胞的培養(yǎng)。
   
使用百林科生產Puredex^® Cyto-1微載體在CytoLinX^® BR 一次性罐體式生物反應器的實驗結果如下：
 
Vero細胞貼壁情況：
   
  CytoLinX^® BR 一次性罐體式生物反應器標準產品包括50L，200L，500L，1000L，2000L 規(guī)模，由罐體、控制器及溫度控制單元 (TCU) 集合而成，可以應用于工業(yè)級哺乳動物、昆蟲類細胞、及其他低剪切力需求的細胞培養(yǎng)。
 
基于DCS構架開發(fā)，其底層邏輯采用西門子PCS 7構建，從而覆蓋了研發(fā)至生產，單臺至上游整廠的自控需求，其自控邏輯符合 ISA 88 控制標準。
 
軟件設計符合GMP及 21 CFR Part 11 要求。同時，為了便捷用戶使用，CytoLinX^® BR 軟件界面設計極簡，所有功能一目了然，且可以極大程度的滿足客戶使用需求。
 
自控系統(tǒng)滿足實時數(shù)據(jù)采集及記錄、PID自動控制、在線監(jiān)控、多參數(shù)級聯(lián)控制等功能，且擁有穩(wěn)定的pH、DO、溫度控制表現(xiàn)。
 
為了更高效的混合效果，百林科推出全新的底部表盤設計，可以維持較高的線性KLa。并提供微泡，中泡，大泡及多種組合的耗材解決方案，滿足各種細胞刁鉆的培養(yǎng)需求。
 
 
參考文獻：
1. Kiesslich, S. and A.A. Kamen, Vero cell upstream bioprocess development for the production of viral vectors and vaccines. Biotechnology Advances, 2020. 44.
2. Merten, O.-W., Advances in cell culture: anchorage dependence. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences, 2015. 370(1661).

 

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