案例詳解FIDA流體誘導(dǎo)分散技術(shù)如何表征蛋白聚集體尺寸、結(jié)合特異性等

2024年7月17日，曾出演《臥虎藏龍》、《唐伯虎點(diǎn)秋香》的著名演員鄭佩佩去世。據(jù)報道早在2019年，鄭佩佩被診斷為神經(jīng)退行性非典型帕金森綜合征——非正式名稱皮質(zhì)基底節(jié)變性（Corticobasal degeneration, CBD）。CBD屬于tau病理，帕金森屬于α-syn病理，CBD診斷比較困難，目前也無特效藥。鄭佩佩選擇將大腦捐贈給Brain Support Network（BSN），遺體捐給香港大學(xué)以供醫(yī)學(xué)研究。

一代女俠，她的偉大不僅體現(xiàn)在藝術(shù)創(chuàng)作上，是無私的奉獻(xiàn)精神的體現(xiàn)，是對人類醫(yī)學(xué)研究巨大的貢獻(xiàn)，更是俠義精神的延續(xù)。俠肝義膽與不凡的氣節(jié)讓人深深觸動。普瑞麥迪公司緬懷鄭佩佩女士的離世，特此匯總了FIDA技術(shù)在近期發(fā)表的一系列關(guān)于神經(jīng)退行性疾病研究的案例，我們相信卓越的科研人員，使用前沿的研究工具，一定能早日攻克神經(jīng)退行性疾病這個惡魔。

FIDA多維表征蛋白聚集體：含量, 粒徑, 結(jié)合, 親和力與動力學(xué), 熱力學(xué)數(shù)據(jù)
神經(jīng)退行性疾病是神經(jīng)元結(jié)構(gòu)或功能逐漸喪失甚至死亡，繼而導(dǎo)致功能性障礙的一類疾病。帕金森氏癥、阿爾茨海默氏癥、亨廷頓氏癥，就是典型的神經(jīng)退行性疾病。

神經(jīng)退行性疾病病理標(biāo)志是錯誤折疊蛋白纖維聚集體的形成。然而表征蛋白聚集體的多種參數(shù)與尋找能夠結(jié)合蛋白聚集體的新型分子面臨著諸多挑戰(zhàn)。傳統(tǒng)的相關(guān)檢測技術(shù)受限于檢測靈敏度、準(zhǔn)確性或通量等問題，在神經(jīng)退行性疾病的研究中存在很多局限性，往往需要多種方法結(jié)合才能得出理想數(shù)據(jù)，但有限的樣本數(shù)量很難支持眾多的實(shí)驗(yàn)類型。

FIDA技術(shù)由于在底層物理原理上的優(yōu)勢，可以解決現(xiàn)有方法無法克服的一系列問題，例如結(jié)合質(zhì)量變化不敏感，蛋白聚集體沉淀，結(jié)合構(gòu)象變化小，Labelfree信號弱難以檢測，樣品量小需要在細(xì)胞裂解液中檢測等問題。FIDA可以在一次實(shí)驗(yàn)中得到目前常用方法得到的多個表征參數(shù)。

下面 ，將通過案例詳細(xì)解析FIDA流體誘導(dǎo)分散技術(shù)如何表征蛋白聚集體尺寸, 結(jié)合特異性, 親和力, 熱力學(xué)等數(shù)據(jù)。

FIDA在淀粉樣蛋白疾病診斷工具肽開發(fā)的應(yīng)用

蛋白質(zhì)聚集與淀粉樣蛋白疾病的發(fā)展有關(guān)，如阿爾茨海默病和亨廷頓病。盡早發(fā)現(xiàn)聚集物非常重要，這是早期診斷的先決條件。本文提出了一種從早期聚集監(jiān)測蛋白原纖維大小的方法。研究者設(shè)計了一種名為FibrilPaint1的肽聯(lián)合FIDA技術(shù)，它能特異性地識別來自疾病的各種原纖維，但不能識別它們的單體，這個特性使FibrilPaint1成為淀粉樣蛋白疾病診斷應(yīng)用的新工具。

篩選FibrilPaint肽，F(xiàn)IDA快速檢測能與Tau和HttEx1Q44單體蛋白與原纖維結(jié)合的多肽

最初，研究者篩選了四種FibrilPaint肽，以直接檢測能否結(jié)合Tau和HttEx1Q44原纖維。使用FIDA技術(shù)，對FibrilPaint肽進(jìn)行熒光標(biāo)記，從熒光信號中測量多肽的絕對水動力半徑(R_h)變化。

圖1，F(xiàn)ibrilPaint1-4都抑制了單體聚集，但FibrilPaint1與Tau和HttEx1Q44原纖維結(jié)合，而且不與其單體結(jié)合

四種FibrilPaint肽都能抑制TauRD的聚集體的產(chǎn)生，但FibrilPaint1不僅有抑制能力，由于它與TauRD親和力很高，可作為蛋白聚集體的非共價標(biāo)簽。這使得FibrilPaint1同時具備的抑制聚集體產(chǎn)生，與作為TauRD的聚集體的標(biāo)簽工具的能力，所以科學(xué)家繼續(xù)利用FIDA與FibrilPaint1開發(fā)可以診斷TauRD相關(guān)疾病的工具與方法。

利用FIDA確認(rèn)在細(xì)胞裂解液和聚集體中FibrilPaint1對纖維結(jié)合的特異性
文章中研究了 FibrilPaint1 是否在不受其他生物分子或細(xì)胞成分干擾的情況下結(jié)合纖維。

圖2，F(xiàn)ibrilPaint1對淀粉樣蛋白聚集體具有特異性

通過加入大腸桿菌細(xì)胞裂解液，測試了其在大量其他細(xì)胞蛋白存在下特異性識別 TauRD 纖維的能力。在 50% 細(xì)胞裂解液中，以 1:100 的比例將預(yù)先形成的 20 小時 TauRD 纖維與 FibrilPaint1 一起孵育。在這些條件下，F(xiàn)ibrilPaint1 的尺寸增加到 39 nm，這與在緩沖液中測量到的相同纖維的 41 nm Rh 值一致（圖3A）。當(dāng)單獨(dú)在細(xì)胞裂解液中孵育 FibrilPaint1 時，其尺寸與單獨(dú)的 FibrilPaint1 保持不變（圖2A）。因此，F(xiàn)ibrilPaint1 能夠在復(fù)雜的細(xì)胞混合物中特異性識別纖維。

接下來，測試了 FibrilPaint1 與聚集體結(jié)合是否需要纖維狀結(jié)構(gòu)。使用螢火蟲熒光素酶作為非淀粉樣蛋白聚集體的標(biāo)準(zhǔn)參照。螢火蟲熒光素酶是一種球狀的 61 KDa 蛋白，其 R_h 為 3.4 nm，在熱沖擊變性時形成無定形聚集體。以 1:100 的比例將 FibrilPaint1 與熱沖擊螢火蟲熒光素酶一起孵育。在 FIDA 測量中，F(xiàn)ibrilPaint1 的 R_h 不受螢火蟲熒光素酶聚集體存在的影響（圖2B）。這表明 FibrilPaint1 不與無定形的螢火蟲熒光素酶聚集體結(jié)合。綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明 FibrilPaint1 在不受其他生物分子干擾的情況下，特異性結(jié)合淀粉樣蛋白纖維。

FIDA快速表征Tau蛋白和Htt蛋白纖維絕對粒徑的動力學(xué)變化
接下來，研究者將FIDA獲得的與單顆粒EM獲得的纖維粒徑大小進(jìn)行比較。使用陰性染色EM成像來表征聚集24小時后的TauRD原纖維和聚集6小時后的HttEx1Q44原纖維的形狀大小。采用ThT和FIDA平行測定兩種蛋白聚集的變化，ThT定性提供淀粉樣蛋白原纖維存在的信號。FIDA量化提供了纖維長度在早期聚集期隨時間的發(fā)展絕度粒徑 R_h大小，與負(fù)染色EM成像數(shù)據(jù)一致。

圖3，TauRD (A)和HttEx1Q44 (D)聚集物的流體動力半徑用FIDA測定。在平行實(shí)驗(yàn)中，TauRD和HttEx1Q44聚集物用ThT測定(B, E)監(jiān)測。TauRD的最終產(chǎn)物在24小時后(C)和6小時后(F)的電鏡染色為陰性，Tau-RD聚集，HttEx1Q44聚合成簇狀

FIDA確定FibrilPaint1結(jié)合特異性——監(jiān)測患者來源的原纖維

FibrilPaint1特異性結(jié)合淀粉樣蛋白原纖維，它可能具有診斷患者蛋白原纖維的潛力。這就要求FibrilPaint1能夠識別患者來源的原纖維。

接下來，研究者評估FibrilPaint1識別多種Tau病變患者源性原纖維的能力，采用了三種不同Tau病變的離體Tau原纖維，分別從診斷為CBD、FTD和AD的已故患者中純化得到。

用陰性染色EM對純化的原纖維進(jìn)行成像，以確認(rèn)典型的疾病特異性原纖維形狀。隨后，進(jìn)行FIDA分析以確定患者來源的Tau原纖維的大小(A)。重組TauRD形成的原纖維平均R_h為54 nm。從診斷為AD的患者中測量的原纖維的表觀平均Rh為40 nm，測量值之間的變化很小(A)。對于CBD，觀察到的R_h為140 nm(圖A)。來自FTD的原纖維是一組均勻的蛋白聚集體，平均 R_h為60 nm(A)。這些數(shù)據(jù)表明，F(xiàn)ibrilPaint1適合與源自原材料的蛋白原纖維相互作用并表征。

最后用這些原纖維中的重復(fù)元素結(jié)合EM數(shù)據(jù)，來確定它們的平均長度。PHF原纖維的平均長度為2.7倍重復(fù)，相當(dāng)于430 nm。這與fibrilpaint1染色原纖維在FIDA實(shí)驗(yàn)中觀察到的420 nm一致。因此，聯(lián)合FibrilPaint1和FIDA是確定病理原纖維長度的合適方法

由于FibrilPaint1可以準(zhǔn)確識別多種不同結(jié)構(gòu)Tau病變患者源性原纖維，所以基于FIDA開發(fā)了一種采用FibrilPaint1標(biāo)記tau原纖維，并且測量原纖維的大小的淀粉樣蛋白疾病診斷工具。

圖5，基于FIDA的FibrilPaint1探測淀粉樣蛋白原纖維的方法

通過FibrilPaint1與不同來源的Tau蛋白的強(qiáng)結(jié)合能力，可以檢測淀粉樣蛋白原纖維的存在。通過FibrilPaint1加上熒光素標(biāo)簽，使結(jié)合了FibrilPaint1的原纖維被染色(橙色途徑)，從而診斷淀粉樣疾病的發(fā)生。然后，染色后的纖維可以用FIDA分析得到蛋白聚集體的水動力半徑(R_h)，其中如聚集體的結(jié)構(gòu)是已知結(jié)構(gòu)中的，可以進(jìn)一步計算出確定纖維的半徑(藍(lán)色途徑)，從而更準(zhǔn)確的診斷Tau蛋白相關(guān)疾病與發(fā)生機(jī)制。

來源：Fibril Paint to detect Amyloids and determine Fibril Length Júlia Aragonès Pedrola, Françoise A. Dekker, Tommaso Garfagnini, Guy Mayer, Margreet B. Koopman, Menno Bergmeijer, Friedrich Förster, Jeroen J. M. Hoozemans, Henrik Jensen, Assaf Friedler, Stefan G. D. Rüdiger bioRxiv 2023.10.13.562220; doi: https://doi.org/10.1101/2023.10.13.562220

FIDA表征淀粉樣蛋白多態(tài)性-熱力學(xué)參數(shù)
α-突觸核蛋白等蛋白質(zhì)的淀粉樣原纖維是神經(jīng)退行性疾病的標(biāo)志，許多研究都集中在它們的動力學(xué)和形成機(jī)制上。關(guān)于這類結(jié)構(gòu)的熱力學(xué)穩(wěn)定性的問題得到的關(guān)注要少得多，通過傳統(tǒng)的技術(shù)方法也十分難以檢測。

在傳統(tǒng)研究蛋白聚集體熱力學(xué)特征時，一般采用化學(xué)解聚的方法。化學(xué)解聚實(shí)驗(yàn)中使用的實(shí)驗(yàn)技術(shù)可分為兩類:第一類通常使用的方法包括(超)離心或色譜(HPLC)，但是十分耗時且樣品消耗大。第二類技術(shù)包括圓二色性、光散射、自發(fā)熒光或硫黃素- t熒光。優(yōu)點(diǎn)是分析混合物而不需要分離，從而實(shí)現(xiàn)快速和高通量的分析。然而，這些方法提供的是相對測量值，而不是所涉及物種的絕對濃度，這在分析過程中引入了一定程度的不確定性。此外，它們可能需要特定熒光團(tuán)(固有熒光)的存在，并可能受到強(qiáng)散射(圓二色性)的限制。

但是在這個案例中，研究人員利用FIDA技術(shù)結(jié)合了以上兩類技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)，研究了19種不同α-突觸核蛋白原纖維多態(tài)性的熱力學(xué)穩(wěn)定性差異，并首次對這些差異進(jìn)行了量化。并且證明了蛋白聚集體的形成可以在動力學(xué)或熱力學(xué)控制下，通過溶液條件的變化可以穩(wěn)定和破壞淀粉樣原纖維。綜上所述，我們的研究結(jié)果將熱力學(xué)穩(wěn)定性作為一個定義良好的關(guān)鍵參數(shù)，有助于更好地理解淀粉樣纖維多態(tài)性的生理作用。
 

圖6，不同結(jié)構(gòu)α-syn蛋白熱力學(xué)特征示意圖

FIDA表征彌漫性和非彌漫性蛋白聚集體顆粒模型
脂質(zhì)體、大納米粒子、蛋白質(zhì)聚集體)在實(shí)驗(yàn)過程中不能徑向擴(kuò)散(或在小于1分鐘的實(shí)驗(yàn)時間尺度內(nèi)邊際擴(kuò)散)，并且在實(shí)驗(yàn)過程中保持在同一層流中，導(dǎo)致它們的信號在檢測器處變形、不對稱分布。在這里，我們利用這種現(xiàn)象來分離非彌散性聚集體和彌散性單體以確定淀粉樣蛋白原纖維的穩(wěn)定性。

首先用COMSOL 126軟件(COMSOL Multiphysics®v. 6.1)對實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了數(shù)值模擬。

為了驗(yàn)證我們的模擬，我們在FIDA儀器上使用αSyn 139單體(wt或F94W突變體)和熒光修飾的聚苯乙烯NPs (d = 200 nm;140 FluoSpheres™，Thermo Fisher)分別作為彌漫性和非彌漫性顆粒模型。兩種物質(zhì)的實(shí)驗(yàn)流動曲線幾乎完全符合COMSOL模擬得到的。此外，非擴(kuò)散粒子的FIDA數(shù)據(jù)與我們之前開發(fā)的Taylor色散誘導(dǎo)相分離(TDIPS )的解析十分近似。

圖8，為FIDA檢測結(jié)果

FIDA表征淀粉樣蛋白原纖維的熱力學(xué)穩(wěn)定性與傳統(tǒng)方法的對比
用不同的技術(shù)測量三種不同淀粉樣蛋白原纖維的熱力學(xué)穩(wěn)定性。F94W αSyn突變原纖維的化學(xué)解聚用包括超速離心(UCF)、FIDA、nanoDSF、ThT和SLS在內(nèi)的所有技術(shù)進(jìn)行了研究。來自ThT熒光的數(shù)據(jù)略超出其他技術(shù)的誤差范圍。通過FIDA，ThT和SLS可以可靠地測量WT αSyn原纖維，但由于缺乏色氨酸（分子只含有4個酪氨酸），nanoDSF由于靈敏度的原因未能像預(yù)期的那樣監(jiān)測單體/原纖維的轉(zhuǎn)化。PI3K-SH3淀粉樣原纖維通過FIDA和nanoDSF測量可得到數(shù)值，但SLS強(qiáng)度數(shù)據(jù)不可靠，原因是在低變性劑濃度下發(fā)生沉淀。綜述FIDA是唯一能夠可靠測量所有3種模型的可靠技術(shù)。
 

圖9：用不同技術(shù)測定的三種不同淀粉樣纖維的熱力學(xué)穩(wěn)定性。(a)采用超速離心法(UCF)、 FIDA、nanoDSF、ThT和SLS技術(shù)對F94W αSyn突變體纖維進(jìn)行了化學(xué)解聚。ThT熒光測得的數(shù)據(jù)略超出其他技術(shù)的誤差范圍。(b) FIDA、ThT、SLS可以準(zhǔn)確地檢測WT αSyn纖維，然而，由于缺乏色氨酸，nanoDSF無法監(jiān)測單體/纖維的變換。(c) FIDA和nanoDSF準(zhǔn)確地測定了PI3K-SH3淀粉樣纖維，但SLS強(qiáng)度數(shù)據(jù)不可靠，最可能的原因是在低變性劑濃度下發(fā)生沉淀
 

表1：比較各熱穩(wěn)定性測量方法：UCF -超速離心法，F(xiàn)IDA -流動誘導(dǎo)分散分析，ThT - Thioflavin T測定法，SLS -靜態(tài)光散射法，DSF -差示掃描熒光法，n.m. -未測量，n.d. - ΔG不能確定

FIDA表征pH對纖維熱穩(wěn)定性的影響
在中性（pH 7.5）條件下和酸性（pH 5.5）條件下分別組裝得到纖維Polymorph N和Polymorph H（圖10. c）。Polymorph N在中性、Polymorhp H中性和酸性條件下，用不同濃度的尿素使其發(fā)生解聚（圖10. b），Polymorph N和Polymohph H在各自對應(yīng)的條件下，Polymorph H比 Polymorph N更穩(wěn)定，但把Polymorph H放在中性條件下，它的穩(wěn)定性大大下降，甚至比Polymorph N更不穩(wěn)定（表2）。可以說，這種纖維穩(wěn)定性的變化是由于αSyn在中性溶液中的溶解度高于酸性溶液，從而導(dǎo)致(部分)纖維在pH巨變時發(fā)生解聚。其他研究也觀察到αSyn纖維在pH變化時發(fā)生類似的不穩(wěn)定，這可能是體內(nèi)發(fā)生的一個重要現(xiàn)象。
 

圖10. 不同α - syn纖維在不同溶液條件下的解聚曲線。(a)在無鹽(NS，紫色)或有鹽(S，藍(lán)色)的條件下制備和測量的纖維的穩(wěn)定性。在鹽(深紫色)的存在下進(jìn)行解聚，以直接比較它們的穩(wěn)定性。(b)在中性（pH 7.4, N，綠色）或酸性（pH 5, H，淺橙）條件下制備并測定纖維的穩(wěn)定性。(c)AFM分析纖維形態(tài)
 

表2：在不同溶液條件下制備并用FIDA測定了不同WT αSyn纖維多態(tài)性的熱力學(xué)穩(wěn)定性。S-鹽條件，NS-無鹽條件，N-中性，H-酸性

來源：Farzadfard A, Kunka A, Mason TO, Larsen JA, Norrild RK, Torrescasana Dominguez E, et al. Thermodynamic characterization of amyloid polymorphism by Taylor dispersion analysis. ChemRxiv. 2023; doi:10.26434/chemrxiv-2023-41scv This content is a preprint and has not been peer-reviewed

利用FIDA確定抑制a-突觸核蛋白寡聚物為靶點(diǎn)的小分子化合物作用機(jī)理
突觸核蛋白(aSO)的小可溶性低聚物與神經(jīng)元穩(wěn)態(tài)的破壞有關(guān)，有助于帕金森病(PD)的發(fā)展。這使得aSO成為一個明顯的藥物靶點(diǎn)，但由于其豐度低、結(jié)構(gòu)和形態(tài)復(fù)雜，開發(fā)有效的治療方法受到挑戰(zhàn)。

首先，利用數(shù)據(jù)庫高通量篩選確定了四種神經(jīng)元蛋白作為aSO相互作用的可能候選蛋白，即Cfl1、Uchl1、Sirt2和SerRS。

圖11，(c) SPR分析測定的aSOs結(jié)合動力學(xué)。將1-15 mM的aSOs通過Cfl1、Uchl1和Sirt2固定在不同通道上的傳感器表面。傳感器圖顯示了SPR結(jié)合信號的時間曲線，其中使用1:1結(jié)合模型最適合結(jié)合區(qū)域的時間曲線以紅色表示。(d)使用FIDA表征aSOs -配體相互作用的原理。(e) aSOs-Alexa488與蛋白配體結(jié)合后的R_h隨配體濃度的變化。(f) aSOs-Alexa488和aSMs-Alexa488與不同濃度的神經(jīng)元細(xì)胞裂解液結(jié)合后的R_h

將3種候選蛋白質(zhì)分別固定在CM5芯片的通道上，測量不同aSO濃度下aSO的結(jié)合動力學(xué)（圖c）。所有蛋白質(zhì)都顯示出結(jié)合信號的濃度依賴性增加（盡管Uch1的信號較弱），結(jié)果Cfl1、Uchl1和Sirt2的估計親和力常數(shù)分別為0.29 μm、0.15 μm和0.6 μm。

但是蛋白質(zhì)的在芯片的固定可能使結(jié)合數(shù)據(jù)的解釋復(fù)雜化。因此，為了確定這些蛋白質(zhì)在溶液中與aSOs的結(jié)合親和力，研究者利用FIDA技術(shù)繼續(xù)驗(yàn)證。

使用Alexa488標(biāo)記的aSOs與未標(biāo)記的配體組合作為指示劑。單獨(dú)的aSO的Rh為10±0.2 nm，這與我們之前基于SEC-MALS和SAXS17報道的~11 nm的Rh相似，并驗(yàn)證了aSO的結(jié)構(gòu)完整性。使用FIDAbio的PDB-R_h預(yù)測工具，我們預(yù)測了四個配體的Rh，它們分別為2.3nm（Cfl1）、2.4nm（Uchl1）、2.8nm（Sirt2）和3.6nm（SerRS）。在與配體結(jié)合后，aSO的Rh預(yù)計將增加到12–13 nm，并且這種增加完全在檢測范圍內(nèi)（因?yàn)閼?yīng)該可以測量低至0.5 nm的增加）。然而，當(dāng)用高達(dá)150mM C��1、Uchl1和Sirt2滴定時，我們看到Rh幾乎沒有變化（圖e）。只有SerRS的圖的大小有一個小但顯著的增加低聚物（從10到~12.5 nm），這僅在高濃度（100-150 mM）下發(fā)生。這一觀察結(jié)果表明，配體與溶液中aSO的結(jié)合親和力非常弱，遠(yuǎn)低于點(diǎn)印跡分析和SPR測量的親和力。

圖12利用FIDA檢測溶液中分子互作親和力，配體與溶液中α-SOs的結(jié)合親和力非常弱，遠(yuǎn)低于點(diǎn)印跡分析和SPR測量的親和力

由于的候選蛋白與aSO的弱相互作用，研究者采用另一個思路使用aSO-膜系統(tǒng)來識別破壞aSO相互作用的小分子。

圖13，aSOs-Alexa488與DOPG脂質(zhì)體結(jié)合后的 R_h作為DOPG脂質(zhì)濃度的函數(shù)。（c） 表觀解離常數(shù)Kd（其中脂質(zhì)濃度以單體單位表示）是使用來（b）的數(shù)據(jù)獲得的

為了闡明與細(xì)胞膜結(jié)合的aSOs的細(xì)胞膜破壞性相互作用，制備了由DOPG脂質(zhì)制成的模擬膜脂質(zhì)體，并使用FIDA對其進(jìn)行相互作用檢測。在測量之前，將aSO-Alexa488和DOPG脂質(zhì)體共孵育15分鐘，隨后在周圍溶劑中用相應(yīng)濃度的脂質(zhì)體樣品進(jìn)行分析。

得到了aSOs-Alexa488與DOPG脂質(zhì)體結(jié)合后的 R_h作為DOPG脂質(zhì)濃度的函數(shù)。（c） 表觀解離常數(shù)Kd（其中脂質(zhì)濃度以單體單位表示）是使用來（b）的數(shù)據(jù)獲得的

后面也用鈣綠黃素的釋放試驗(yàn)再次驗(yàn)證了，aSO蛋白對于膜的滲透性的增加，表面了蛋白與膜結(jié)合并破壞性造成膜通透性增加滲出鈣離子的機(jī)制，驗(yàn)證了FIDA得出的結(jié)果。

為了尋找可破壞aSOs與膜結(jié)合的化合物，篩選了兩個數(shù)據(jù)集的化合物，包括FDA批準(zhǔn)的(Prestwick文庫)和臨床階段的生物活性藥物(Biomol文庫)。我們使用EGCG和橄欖苦苷作為陽性對照和陰性對照，以鈣綠黃素實(shí)驗(yàn)為指標(biāo)篩選了11種最優(yōu)化合物A1-A11。

圖14，在存在和不存在脂質(zhì)體的情況下，通過FIDA分析αSO與化合物的相互作用。（a） 在DOPG脂質(zhì)體和化合物存在下，最大種類的aSO-Alexa488的表觀尺寸（R_h）。R_h的值和種類的百分比可以分別在左y軸和右y軸上讀取。（b） 在化合物存在下的游離αSO-Alexa488（即不含脂質(zhì)體）的R_h

綜合a，b圖與elisa結(jié)果，得出了小分子化合物結(jié)合抑制α核突觸蛋白的三種作用機(jī)制：

1. 1.A1-4，A6，完全抑制了膜復(fù)合體形成，但αSO大小不變
2. 2.A5,7,8,9,10不完全抑制復(fù)合體形成
3. 3.A2，3， EGCG增加了αSyn單體數(shù)量

圖15，化合物抑制α核突觸蛋白的三種作用機(jī)制

來源：Drug repurposing screens identify compounds that inhibit α-synuclein oligomers' membrane disruption and block antibody interactions  2023

FIDA——Capflex方法表征α-突觸核蛋白 (α-Syn) 液液相分離揭示淀粉樣蛋白原纖維的形成機(jī)理
α-突觸核蛋白 (α-Syn) 能夠發(fā)生 LLPS ，隨后可以由液相轉(zhuǎn)變?yōu)楣滔啵瑥亩鴮?dǎo)致淀粉樣蛋白原纖維的形成，這一過程可能是病理性的。

研究結(jié)果表明α-Syn液滴經(jīng)歷了液體到固體樣的轉(zhuǎn)變，這導(dǎo)致了含有纖維聚集體和低聚物的水凝膠的形成。此外，α-Syn甚至在細(xì)胞內(nèi)形成液滴，隨后轉(zhuǎn)化為固體狀聚集體，并且是由微管調(diào)節(jié)的。表明液液相分離是PD病理相關(guān)α-Syn聚集的第一步。

在100µM的α-Syn溶液中加入10nM的Alexa488標(biāo)記的α-Syn與20% PEG6000，37℃孵育，每隔4小時（48小時）進(jìn)行Capflex測量。在0h時，沒有觀察到峰值，這表明樣品沒有相分離；孵育4-8小時后，開始出現(xiàn)小而稀疏的峰，輕相濃度下降，這時相分離開始了；6h后，α-Syn相分離成液滴，稀相濃度下降到70µM，直到24h時幾乎保持不變；當(dāng)孵育時間達(dá)到30-48h時，即使在稀釋樣品后，信號峰值也沒有消失(右圖)。48h后，基線熒光達(dá)到2-5µM，表明α-Syn在指數(shù)相中發(fā)生了不可逆的液固轉(zhuǎn)變和聚集。

圖16， 在100µM的α-Syn溶液中加入10nM的Alexa488標(biāo)記的α-Syn與20%PEG6000，37℃孵育，每隔4小時（48小時）進(jìn)行Capflex測量
 

圖17，ThT蛋白各階段信號峰結(jié)果與α-Syn發(fā)生LLPS各階段示意圖

通過FIDA Aggregation分析，α-Syn LLPS溶液(100µM）發(fā)生LLPS的滯后時間為20-24小時；指數(shù)聚集階段在孵育20-24小時后開始，并持續(xù)50小時到飽和（左圖）。Capflex的數(shù)據(jù)清楚地表明，這種新的定量方法可檢測到α-Syn發(fā)生LLPS的開始對應(yīng)于蛋白聚集的滯后階段。不可逆的液-固相變和淀粉樣蛋白聚集主要發(fā)生在指數(shù)階段（20-40h），這可以通過稀釋相濃度的進(jìn)一步降低和30h后的并且和ThT陽性信號峰結(jié)果一致得到證實(shí)。

FIDA定量表征LLPS的方法Capflex。與光漂白熒光恢復(fù)實(shí)驗(yàn)（FRAP)這類定性實(shí)驗(yàn)不同，其可以高通量、快速和準(zhǔn)確地定量LLPS的多個關(guān)鍵參數(shù)：輕相濃度，相對液滴大小分布，以及液滴的形成，從而揭示淀粉樣原纖維的動力學(xué)。

來源：Capillary flow experiments for thermodynamic and kinetic characterization of protein liquid-liquid phase separation，nature communications

FIDA檢測FapA與FapB/FapC的相互作用機(jī)制
生物被膜（Biofilms）是指黏附于非生物或生物表面后，細(xì)菌通過分泌的胞外聚合物(extracellular polymeric substances, EPS)將自身包裹其中而形成的細(xì)菌聚集體膜狀物。生物被膜對化學(xué)降解和抗生素具有高度的抗藥性，使得這些感染頻繁復(fù)發(fā)、治療困難。生物膜具有高穩(wěn)定性和抗性的原因之一是淀粉樣原纖維，它能夠穩(wěn)固結(jié)構(gòu)。靶向淀粉樣蛋白形成、中斷生物被膜形成是增加藥物的抗菌性的有效策略。假單胞菌（Pseudomonas，F(xiàn)ap）的功能性淀粉樣蛋白包括主要成分FapC、次要成分FapB（促進(jìn)FapC成核）和小的周質(zhì)蛋白FapA（條件原纖維的組成和形態(tài)），這三種成分的相互作用是Fap纖維發(fā)展的核心機(jī)制。為了更好的理解FapA影響原纖維的機(jī)制，作者利用FIDA研究了FapA與FapC/FapB 之間的相互作用。
 

圖18 .FIDA表征FapA與FapB/FapC相互作用。（A）1μM FapA-Alexa 488分別滴定FapC（紅）、FapB（藍(lán)）；（B）0.25μM FapC-Alexa 488（紅）、1.5μM-Alexa 488 FapB（藍(lán)）分別滴定FapA

為了更好地了解FapA的潛在機(jī)制，使用FIDA研究了FapA與FapB或FapC之間的相互作用。用熒光探針Alexa Fluor 488標(biāo)記FapA，并與逐漸增加的FapB或FapC預(yù)混液。FapA會在FapB或FapC之間形成絡(luò)合物，當(dāng)更多的FapB或FapC加入后，隨著平衡向絡(luò)合物形成時，分子水動力學(xué)半徑大小應(yīng)該增加。圖(A)顯示，加入FapC后，尺寸增加，而加入FapB不增加，說明FapA與FapC形成復(fù)合物，而不與FapB形成復(fù)合物。

來源：FapA is an Intrinsically Disorered Chaperone for Pseudomonas Functional Amyloid FapC 2023

關(guān)于FIDA

FIDA（Flow induced dispersion analysis，流動誘導(dǎo)分散分析）是最新推出的第一性原理的生物物理分析平臺，利用泰勒分散的原理，基于粒子在層流狀態(tài)下分散的特性，來測量粒子大�。�流體力學(xué)半徑R_h）。在層流狀態(tài)下，流體在平行層中平滑地流動，不會發(fā)生混合。中心層流速要比貼近毛細(xì)管壁層的流速要快，從而產(chǎn)生了典型的拋物線流速度剖面。小的顆粒(如小分子\蛋白質(zhì))在層間擴(kuò)散并以平均流速移動，使得它們在檢測點(diǎn)的濃度呈高斯分布，它們的擴(kuò)散系數(shù)(Dapp)可以通過擬合泰勒分散來獲得，并根據(jù)Stokes-Einstein方程來確定它們的水動力半徑(R_h)。這種技術(shù)符合第一原理定律，能夠測量分子的真實(shí)大小R_h，具有非常重要的生物學(xué)意義，可以有效的監(jiān)測蛋白早期的聚集（如Htt、Tau）、蛋白低聚物/纖維的相互作用。

對于較大的粒子(如脂質(zhì)體、大納米顆粒、蛋白聚集體等)在實(shí)驗(yàn)過程中不能呈徑向擴(kuò)散，且在實(shí)驗(yàn)過程中始終處于同一流層中，導(dǎo)致其在檢測器上的信號分布不均勻。利用這種特性，可以從分散性的單體中區(qū)分出非分散性的聚合物（纖維），從而表征蛋白纖維的熱穩(wěn)定性 。不僅如此，F(xiàn)IDA是一項功能強(qiáng)大且全面的技術(shù)，從結(jié)構(gòu)到結(jié)合再到熱力學(xué)穩(wěn)定性一應(yīng)俱全。其測量的是分子的真實(shí)大小， FIDA的檢測結(jié)果與現(xiàn)有方法具有一致性，同時實(shí)驗(yàn)成本極低，無需特殊的耗材，一次測量僅消耗40nL的樣品；通過檢測分子R_h的變化，對分子間的相互作用進(jìn)行定性實(shí)驗(yàn)，操作簡單，僅需幾分鐘就可以得到結(jié)果；通過滴定實(shí)驗(yàn)，以R_h的變化繪制結(jié)合曲線，可以得到分子互作的親和力，從一個分子大小變化的角度去觀察分子間的相互作用，同時還可以通過構(gòu)象導(dǎo)致的分子熒光變化來獲得親和力，對于親和力的獲取可以同時用正交的方法驗(yàn)證。此外，F(xiàn)IDA可以測定K_on/K_off，對于分子與聚集體的結(jié)合動力學(xué)可以有效表征。

FIDA技術(shù)檢測速度快，無需擔(dān)心樣品在檢測期間發(fā)生變化從而影響結(jié)果。檢測靈敏度高，不僅僅依賴于單一指標(biāo)，可多維表征蛋白聚集體粒徑，結(jié)構(gòu)，親和力，動力學(xué)與熱力學(xué)，并且還能反饋樣品聚集信息。不同類型的蛋白聚集體樣本都可通過FIDA進(jìn)行可靠檢測，這個功能是其他技術(shù)無法實(shí)現(xiàn)的。

FIDA在神經(jīng)退行性疾病研究的相關(guān)文獻(xiàn)：
1.Thermodynamic characterization of amyloid polymorphism by microfluidic transient incomplete separation  2023
2.Thermodynamic characterization of amyloid polymorphism by Taylor dispersion analysis  2023
3.Specific inhibition of α-synuclein oligomer generation and toxicity by the chaperone domain Bri2 BRICHOS  2023
4.Fibril Paint to detect amyloids and determine fibril length  2023
5.Drug repurposing, inhibit aSN oligomers' membrane disruption  2023
6.FapA is an Intrinsically Disorered Chaperone for Pseudomonas Functional Amyloid FapC  2023
7.Capillary flow experiments for thermodynamic and kinetic characterization of protein liquid-liquid phase separation 2021
8.Drug repurposing screens identify compounds that inhibit α-synuclein oligomers' membrane disruption and block antibody interactions  2023