靶向MsrA的SMLC減輕Ang II誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激和心房重構(gòu)研究

鈣在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，尤其是心肌細(xì)胞中起關(guān)鍵作用。氧化的鈣/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶 II（ox-CaMKII）作為房顫模型和房顫患者中 CaMKII 的激活劑，與絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）途徑激活有關(guān)，參與 AF 的發(fā)病機(jī)制。此前研究表明，線粒體 CaMKII 通過 MAPK/AP-1 信號通路參與線粒體氧化應(yīng)激和心房重構(gòu)。但 MsrA 在 ROS 誘導(dǎo)的 AF 中對 ox-CaMKII 和 MAPK 信號通路的介導(dǎo)作用尚未完全闡明，且缺乏藥物治療策略。

基于此，北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院心外科王輝山教授團(tuán)隊(duì)發(fā)表了題目為："S-methyl-L-cysteine targeting MsrA attenuates Ang II-induced oxidative stress and atrial remodeling via p38 MAPK signaling pathway"的文章。

本研究介紹S-甲基-L-半胱氨酸（SMLC）是含巰基的有機(jī)硫化合物，在各種食用蔬菜中含量豐富。它是甲硫氨酸的生物對應(yīng)物，可能通過靶向 MsrA  消除自由基。旨在評估 SMLC 對阻止血管緊張素 II（Ang II） 誘導(dǎo)的心房顫動的效果，研究 MsrA 的作用，并探討 p38 MAPK 信號通路相關(guān)的機(jī)制。

研究方法：
文中采用64 通道電生理標(biāo)測系統(tǒng)（MappingLab）記錄心房電生理信號：離體心臟 Langendorff 灌流，64 通道電極貼在左心房，記錄心房的平均傳導(dǎo)速度和絕對不均勻性等指標(biāo)。

研究結(jié)果：

1. SMLC 對 Ang II 誘導(dǎo)的生理特征變化和心房擴(kuò)張的影響

為探究 SMLC 對 AF 心房重構(gòu)的治療效果，用持續(xù)釋放 Ang II 的植入式滲透劑構(gòu)建 AF 模型。實(shí)驗(yàn)前各組血壓無顯著差異，用 Ang II 后血壓升高，SMLC 能濃度依賴性降壓，各組體重?zé)o差異。通過超聲心動圖評估，Ang II 組左心房直徑和面積大，SMLC 能濃度依賴性改善這種情況，表明 SMLC 能改善 Ang II 誘導(dǎo)的高血壓和心房擴(kuò)張重構(gòu)。（圖1）

圖1. SMLC 對 Ang II 誘導(dǎo)的生理特征改變和心房擴(kuò)張的影響
 

2. SMLC 減輕了 Ang II 誘導(dǎo)的心房顫動易感性和心房電異常

在 Ang II 刺激的小鼠模型中，房顫的發(fā)生率增加（71.4%），顯著高于 Ang II + L-SMLC 組以及Ang II + M-SMLC 和Ang II + H-SMLC 組。結(jié)果表明，SMLC 能夠降低房顫的易感性。

與對照組相比，Ang II 組的平均傳導(dǎo)速度顯著降低，左心房電傳導(dǎo)的絕對不均勻性和心房率顯著更高，而 SMLC 干預(yù)可逆轉(zhuǎn)此現(xiàn)象。這些發(fā)現(xiàn)表明，SMLC 改善了房顫的易感性，并對心房電活動具有保護(hù)作用。（圖2）

圖2. SMLC 對 Ang II 誘導(dǎo)的高房顫易感性和心房電異常的影響

3. SMLC 可減輕由 Ang II 治療引起的心房纖維化

Ang II 會誘導(dǎo)心房結(jié)構(gòu)重塑，特征是纖維化。通過 Masson’s trichrome 染色法和纖維化前標(biāo)志物研究發(fā)現(xiàn)，SMLC 以濃度依賴方式抑制 Ang II 導(dǎo)致的纖維化增加，逆轉(zhuǎn)纖維化前標(biāo)志物水平升高，表明 SMLC 改善了這種心房結(jié)構(gòu)重塑，與超聲心動圖檢測結(jié)果相符。（圖3）

圖3. SMLC 對體內(nèi) Ang II 誘導(dǎo)的纖維化的影響

4. SMLC 在體內(nèi)逆轉(zhuǎn) Ang II 誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷

通過 DHE 染色、測量 GSH/GSSG 比率及特征標(biāo)志物等方法，研究氧化應(yīng)激損傷程度。發(fā)現(xiàn) SMLC 以濃度依賴形式對 Ang II 誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷有保護(hù)作用，能降低 MitoSox 熒光強(qiáng)度，逆轉(zhuǎn) Ang II 組 GSH/GSSG 比率、SOD1 和 NOX2 表達(dá)及炎性細(xì)胞因子的異常，表明 SMLC 能改善氧化應(yīng)激損傷和炎癥。（圖4）

圖4. SMLC 對體內(nèi) Ang II 誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激的影響

5. Ang II 與對照組以及不同劑量 SMLC 與 Ang II 之間共享差異表達(dá) mRNA 的鑒定

為鑒定 mRNA，構(gòu)建并測序相關(guān)小鼠心房的 RNA-seq 文庫，評估差異表達(dá) mRNA。對 Ang II 與對照、不同劑量 SMLC 與Ang II 的成對比較進(jìn)行差異表達(dá) mRNA（DEGs）評估，它們有共享 DEGs，這可能在 SMLC 對心房功能障礙的影響中起關(guān)鍵作用。檢測關(guān)鍵蛋白表達(dá)，發(fā)現(xiàn) SMLC 對Ang II 誘導(dǎo)的心房重塑的保護(hù)作用與 MsrA、ox-CaMKII 和 p38 MAPK 信號通路有關(guān)。（圖5）

圖5. Ang II 與對照以及不同劑量的 SMLC 之間差異表達(dá)的 mRNA 和蛋白質(zhì)的鑒定

6. SMLC 靶向 MsrA 對 Ang II 處理的 HL-1 細(xì)胞活力的影響

S-甲基-L-半胱氨酸化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖 6A，分子對接分析顯示其與 MsrA 親和力強(qiáng)。研究其對Ang II 誘導(dǎo)的 HL-1 細(xì)胞毒性影響，發(fā)現(xiàn)24小時后有影響，因此選擇10 μM Ang II 處理24小時后續(xù)實(shí)驗(yàn)。SMLC 一定濃度范圍24小時能減輕毒性。此外，Western blot 檢測顯示，與對照組相比，10 μM Ang II 處理24小時后 HL-1 細(xì)胞的MsrA表達(dá)顯著降低，SMLC 可逆轉(zhuǎn)這一趨勢。這些結(jié)果表明，SMLC 靶向 MsrA 可抑制 Ang II 誘導(dǎo)的體外細(xì)胞毒性。（圖6）

圖6. 靶向 MsrA 的 SMLC 對 Ang II 處理的 HL-1 細(xì)胞存活率的影響

7. SMLC 通過靶向 MsrA 抑制了Ang II 誘導(dǎo)的 HL-1 細(xì)胞中的氧化應(yīng)激損傷

作者進(jìn)一步驗(yàn)證了 SMLC 通過介導(dǎo) MsrA 對 HL-1細(xì)胞 Ang II 誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷的改善作用。Ang II 處理誘導(dǎo)線粒體膜去極化，證明了聚合/單體 JC-1 的比例降低，SMLC 逆轉(zhuǎn)了這一趨勢。siMsrA 治療最終減少了線粒體膜的去極化。與對照組和 Ang II+SMLC 組相比，Ang II 明顯表現(xiàn)出更大的氧化應(yīng)激損傷，其特征是 DHE-red 染色增加，氧化應(yīng)激標(biāo)志物改變，SOD1 表達(dá)降低，NOX2表達(dá)增加。同樣，siMsrA 處理進(jìn)一步惡化了HL-1細(xì)胞的氧化應(yīng)激。這些數(shù)據(jù)表明，SMLC對 Ang II 誘導(dǎo)的 HL-1 細(xì)胞氧化應(yīng)激和線粒體功能障礙的保護(hù)作用是由 MsrA 介導(dǎo)的。（圖7）

圖7. SMLC 通過靶向抑制 Ang II 誘導(dǎo)的 HL-1 細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷

8. 由 p38 MAPK 介導(dǎo)的 SMLC 靶向 MsrA 對Ang II 誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用

Western blotting 分析表明 SMLC 的作用被 siMsrA 處理減弱。用 p38 MAPK 抑制劑 SB203580 處理 HL-1 細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)其能消除 siMsrA 誘導(dǎo)的線粒體損傷增加，且 SB203580 能逆轉(zhuǎn) siMsrA 誘導(dǎo)的 ox-CaMKII/CaMKII 增加，表明 SMLC 對氧化應(yīng)激和線粒體功能障礙的保護(hù)作用是由 p38 MAPK 信號通路介導(dǎo)的。（圖8）

圖8. 由 p38 MAPK 介導(dǎo)的 SMLC 靶向 MsrA 對 Ang II 誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用

總之，這是首次揭示 SMLC、氧化應(yīng)激和心房重構(gòu)之間聯(lián)系的研究。此研究探索了 SMLC 影響 MsrA 以抑制 p38 MAPK 信號通路的作用機(jī)制，揭示 SMLC 對房顫患者心房重構(gòu)的潛在治療作用，具有臨床轉(zhuǎn)化意義。

機(jī)制的示意圖