PCR、qPCR和RT-PCR的特點(diǎn)、操作步驟及常見問題的原因

PCR 作為分子生物學(xué)的超級(jí)工具，有著多種變體。今天，我們就來深入聊聊各類 PCR 的區(qū)別及實(shí)驗(yàn)操作步驟，讓你從此對(duì) PCR 了如指掌！

01
各類 PCR ，分不清？

PCR (Polymerase Chain Reaction) 即聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，是指在 DNA 聚合酶催化下，以母鏈 DNA 為模板，以特定引物為延伸起點(diǎn)，反應(yīng)體系中加入 dNTP、Mg2+ 等原料，通過變性、退火、延伸等步驟，體外復(fù)制出與母鏈模板 DNA 互補(bǔ)的子鏈 DNA 的過程，可快速特異性地在體外擴(kuò)增目的 DNA[1][2]。

知識(shí)鏈接

• Ct 值 (Cycle threshold，循環(huán)閾值)，是指 qPCR 反應(yīng)中熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定閾值時(shí)對(duì)應(yīng)的循環(huán)數(shù) (一般 Ct 值在 20-30 之間)。

• 擴(kuò)增曲線 (Amplification curve) 是指隨 PCR 反應(yīng)進(jìn)行，根據(jù)熒光信號(hào)強(qiáng)度隨著循環(huán)數(shù)變化而繪制的曲線。正常的擴(kuò)增曲線 (S 型) 包括四個(gè)階段：基線期、指數(shù)增長期、線性增長期、平臺(tái)期。

• 熔解曲線 (Dissociation curve) 是指隨溫度升高 DNA 的雙螺旋結(jié)構(gòu)降解程度的曲線。

• 擴(kuò)增子 (Amplicon) 為DNA或RNA擴(kuò)增后的一段核苷酸序列。比如通過PCR擴(kuò)增得到的某個(gè)基因的擴(kuò)增片段。更簡單地說，擴(kuò)增子是經(jīng)過人工擴(kuò)增的DNA片段或RNA片段的擴(kuò)增產(chǎn)物。

 
PCR 在基礎(chǔ)科學(xué)研究 (如基因功能分析、基因檢測(cè))、醫(yī)學(xué)診斷 (如病原體檢測(cè)和遺傳病篩查)、法醫(yī)鑒定 (如身份鑒定) 以及環(huán)境監(jiān)測(cè) (如生物多樣性研究) 等具有廣泛的應(yīng)用，是現(xiàn)在生物技術(shù)和遺傳研究的核心工具。

 
當(dāng)然，各類 PCR 實(shí)驗(yàn)除了在特點(diǎn)、應(yīng)用、優(yōu)缺等有諸多不同之外，其實(shí)驗(yàn)操作也是有區(qū)別滴~接下來就和小 M 一起來看下它們的操作步驟吧！ 

02
常規(guī) PCR

PCR 的基本成分包括模板 DNA、引物、反應(yīng)緩沖液、游離核苷酸、聚合酶、鹽和水 (不含核酸酶和污染 DNA) 等。只要目標(biāo)區(qū)域兩側(cè)的堿基序列 (尋找的特定 DNA 序列)是已知的，幾乎任何 DNA 區(qū)域都可以作為 PCR 擴(kuò)增的模板[10]。

在典型的 PCR 分析中，通過重復(fù)簡單的三步過程：變性、退火和延伸，目標(biāo)區(qū)域即可完成擴(kuò)增 (圖 1)。

圖 1. PCR 反應(yīng)流程圖^[10]。

 
基本步驟：

(1) 準(zhǔn)備反應(yīng)體系：模板 DNA、引物 (正、反向)、dNTPs (dATP、dTTP、dCTP、dGTP)、PCR 反應(yīng)緩沖液 (提供合適的 pH 和離子強(qiáng)度)、耐高溫 Taq DNA 聚合酶、去離子水等。也可直接使用 PCR Mix。
(2) PCR 擴(kuò)增：設(shè)置 PCR 擴(kuò)增程序 (包含變性、退火、延伸、循環(huán)、徹底延伸)。
(3) 檢測(cè)：通過瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增效果。

03
實(shí)時(shí)熒光定量 PCR (qPCR)

實(shí)時(shí)熒光定量 PCR (Quantitative Real-time PCR, qPCR) 是 DNA 的實(shí)時(shí) PCR 擴(kuò)增，通過熒光探針測(cè)量，最常見的是插入染料或基于水解的探針，從而實(shí)現(xiàn) PCR 產(chǎn)物的定量 (見圖 2)。該技術(shù)常用于檢測(cè)病原體的存在和確定感興趣的 DNA 序列的拷貝數(shù)。

 
同樣要經(jīng)過多個(gè)擴(kuò)增循環(huán)，其中模板 DNA 最初變性，然后是針對(duì)特定序列的寡核苷酸引物的退火，隨后通過耐熱 DNA 聚合酶從每個(gè)退火引物延伸互補(bǔ)鏈，導(dǎo)致擴(kuò)增子數(shù)量在 PCR 期間呈指數(shù)增長，擴(kuò)增子數(shù)量的增加是在 PCR 過程中通過熒光報(bào)告基因檢測(cè)“實(shí)時(shí)”記錄的。

基本步驟：

(1) 準(zhǔn)備反應(yīng)體系：模板 DNA 或經(jīng)過逆轉(zhuǎn)錄得到的 cDNA、引物 (正、反向)、熒光染料 (如 SYBR Green) 或探針 (如 Taq man 探針、qPCR 探針等)、dNTPs   (dATP、dTTP、dCTP、dGTP)、PCR 反應(yīng)緩沖液 (提供合適的 pH 和離子強(qiáng)度)、耐高溫 Taq DNA 聚合酶或?qū)Ｓ玫臒晒?PCR 聚合酶、去離子水等。也可直接使用 qPCR Kit。
(2) PCR 擴(kuò)增：同常規(guī) PCR，并設(shè)置熒光檢測(cè)步驟。
(3) 熒光檢測(cè)：通過熒光探針或染料實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)熒光信號(hào)。
(4) 數(shù)據(jù)分析：根據(jù) Ct 值和標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣本中的目標(biāo) DNA 或 RNA 濃度。

常用兩種報(bào)告系統(tǒng)：插入式 SYBR Green 測(cè)定法和 TaqMan 探針系統(tǒng)。

01
SYBR Green 

• SYBR Green 通過插入相鄰堿基對(duì)與所有雙鏈 DNA 結(jié)合，發(fā)出熒光信號(hào) (圖 3A)。

• 在未結(jié)合狀態(tài)下，SYBR Green 不發(fā)出熒光。因此，在每個(gè)周期中，通過熒光的相應(yīng)增加來測(cè)量模板擴(kuò)增。

02
TaqMans 探針

• 退火過程中，Taq Man 探針和引物與模板結(jié)合。當(dāng) Taq Man 探針完好無損時(shí)，能量在猝滅器和報(bào)告器之間傳遞，因此，沒有檢測(cè)到熒光信號(hào)。

• 當(dāng) Taq 聚合酶合成新鏈時(shí)，該酶的 5’ 外切酶活性會(huì)切割帶有標(biāo)記的探針上的 5’ 核苷酸，從而使報(bào)告分子從探針上釋放出來。一旦它不再靠近，來自探針的熒光信號(hào)被檢測(cè)到，并通過熒光的相應(yīng)增加記錄模板擴(kuò)增 (圖 3B)。

 
04
逆轉(zhuǎn)錄 PCR (RT-PCR)

逆轉(zhuǎn)錄 PCR (Reverse transcription PCR, RT-PCR) 可使用 RNA 作為模板生成互補(bǔ) DNA (cDNA)。利用逆轉(zhuǎn)錄酶，產(chǎn)生 cDNA 的單鏈拷貝。然后，這可以通過 DNA 聚合酶擴(kuò)增，產(chǎn)生雙鏈 cDNA，進(jìn)入基于 PCR 的標(biāo)準(zhǔn)擴(kuò)增過程 (圖 4A)。

該技術(shù)可用于目標(biāo)基因 (GOIs) 的分子克隆，其可研究用抑制劑、興奮劑、小干擾 RNA (siRNA) 或敲除模型等處理模型系統(tǒng)后基因表達(dá)的變化。這項(xiàng)技術(shù)也經(jīng)常用于檢測(cè) RNA-Seq 實(shí)驗(yàn)之前 (作為質(zhì)量控制) 和之后 (確認(rèn)變化) 的表達(dá)變化。

基本步驟：

(1) 準(zhǔn)備反應(yīng)體系：提取 RNA，加入逆轉(zhuǎn)錄酶 (常用的逆轉(zhuǎn)錄酶有 M-MLV 逆轉(zhuǎn)錄酶和 AMV 逆轉(zhuǎn)錄酶)、引物 (通常使用隨機(jī)引物，oligo (dT) 引物或基因特異性引物)、dNTPs (dATP、dTTP、dCTP、dGTP)、反轉(zhuǎn)錄緩沖液 (提供合適的 pH 和離子強(qiáng)度)、RNase 抑制劑 (防止 RNA 在反應(yīng)過程中降解)、去離子水等。也可直接使用 RT-PCR Kit。
(2) 逆轉(zhuǎn)錄：設(shè)置逆轉(zhuǎn)錄程序。
(3) PCR 擴(kuò)增：以合成的 cDNA 為模板進(jìn)行 PCR 或 qPCR 實(shí)驗(yàn)。(RT-qPCR 分一步法 RT-qPCR 和兩步法 RT-qPCR 兩種)。
(4) 產(chǎn)物分析：通過瓊脂糖凝膠電泳 (RT-PCR) 或熒光信號(hào) (RT-qPCR) 分析擴(kuò)增效果。

此外，一種將 RT-PCR 與 qPCR 相結(jié)合的技術(shù)，逆轉(zhuǎn)錄定量實(shí)時(shí) PCR (Reverse transcription  quantitative real-time PCR, RT-qPCR)。通過在 qPCR 反應(yīng)中使用 cDNA 來測(cè)量 RNA 水平，從而可以快速檢測(cè)基因表達(dá)變化 (圖 4B)。

圖 4. RT-PCR 和 RT-qPCR 流程圖^[11]。

注：RNA 質(zhì)量至關(guān)重要�。�！OD_260/280=1.9-2.1 的 RNA 才 "優(yōu)秀" 。

此外，選擇合適的內(nèi)參 (或內(nèi)標(biāo)) 是非常重要的，這關(guān)系到實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。小 M 為大家整理了qPCR 常用的內(nèi)參基因參考，需要的小伙伴可關(guān)注收藏喔~ 
 

 
選擇策略 Tips：根據(jù)實(shí)驗(yàn)樣本類型進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)測(cè)試候選內(nèi)參基因在目標(biāo)樣本中表達(dá)的穩(wěn)定性確定合適的內(nèi)參基因。

05
數(shù)字 PCR (dPCR)

數(shù)字 PCR (Digital PCR, dPCR) 是目前可用的另一種強(qiáng)大技術(shù)，在臨床診斷中有著廣泛的應(yīng)用。其中，dPCR 方法用于液體活檢中的癌癥監(jiān)測(cè)和器官移植排斥監(jiān)測(cè)等應(yīng)用，這兩種方法都基于檢測(cè)患者樣本中低豐度的無細(xì)胞 DNA[13]。

dPCR 技術(shù)的原理 (圖 5) 涉及將具有制備的 PCR 溶液的樣本分離成大量分區(qū) (通常為納升大小的液滴)，其中單獨(dú)進(jìn)行 PCR 反應(yīng)。每個(gè)分區(qū)包含零個(gè)、一個(gè)或幾個(gè)目標(biāo) DNA 副本，遵循泊松分布 (Poisson distribution)。

在熒光探針存在下進(jìn)行等位基因特異性 PCR 反應(yīng)后，通過熒光檢測(cè)含有擴(kuò)增目標(biāo)序列的分區(qū)。每個(gè)分區(qū)單獨(dú)進(jìn)行熒光掃描，根據(jù)目標(biāo) DNA 的副本是否存在，讀數(shù)為“1”或“0”。陽性分區(qū)占總數(shù)的比例可以確定樣本中目標(biāo)序列的濃度。

基本步驟：

(1) 樣本準(zhǔn)備：模板 DNA 或通過逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)得到的 cDNA，調(diào)整至合適濃度用于后續(xù)分配過程。
(2) 反應(yīng)體系準(zhǔn)備：模板 DNA 或 cDNA、引物 (正、反向)、熒光染料 (常用 SYBR Green) 或探針 (如 Taqman 探針、qPCR 探針等)、dNTPs (dATP、dTTP、dCTP、dGTP)、PCR 反應(yīng)緩沖液 (提供合適的 pH 和離子強(qiáng)度)、耐高溫 Taq DNA 聚合酶或?qū)Ｓ玫臄?shù)字 PCR 聚合酶、去離子水等。
(3) 反應(yīng)體系分配：將反應(yīng)混合液分為多個(gè)微反應(yīng)單元。
(4) PCR 擴(kuò)增：設(shè)置 PCR 擴(kuò)增程序，每個(gè)微反應(yīng)單元獨(dú)立進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增反應(yīng) (包含變性、退火、延伸、循環(huán)、徹底延伸)。
(5) 數(shù)據(jù)分析：檢測(cè)陽性反應(yīng)單元數(shù)量并定量分析樣本中目標(biāo) DNA 或 RNA 的濃度。
 
注意事項(xiàng)：

• 設(shè)置合適的陰性對(duì)照和陽性對(duì)照可確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。
• 數(shù)字 PCR 一般需要比常規(guī) PCR 更多的循環(huán)次數(shù)，因?yàn)樵谟械奈⒎磻?yīng)單元中的模板可能經(jīng)過幾次循環(huán)之后才開始擴(kuò)增反應(yīng)。高次數(shù)循環(huán)反應(yīng)能保證只要孔中有模板，每個(gè) PCR 孔中都能產(chǎn)生幾乎相等的 PCR 產(chǎn)物。 

06
小結(jié)

PCR 技術(shù)是分子生物學(xué)研究的利器，了解掌握各類 PCR 的特點(diǎn)、操作步驟及常見問題的原因，有助于提高實(shí)驗(yàn)成功率，為科研提供可靠數(shù)據(jù)支持。希望這篇整理對(duì)你有所幫助！如果有更多問題或經(jīng)驗(yàn)分享，歡迎在評(píng)論區(qū)留言，我們一起探討學(xué)習(xí)！ 

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Catalog No.	Drug Name
HY-K0531	2× PCR Master Mix (with Dye)
HY-K0501	SYBR Green qPCR Master Mix
HY-K0501A	SYBR Green qPCR Master Mix (Universal)
HY-K0511A	RT Master Mix for qPCR Ⅱ (gDNA digester plus)
HY-K0510A	RT Master Mix for qPCR Ⅱ
HY-K0512	RT Master Mix for qPCR Ⅲ (poly A)

參考文獻(xiàn)：
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