OPM-293 CD05完全化學(xué)成分確定培養(yǎng)基應(yīng)用及培養(yǎng)流程

OPM-293 CD05 是完全化學(xué)成分確定（Chemically-defined）的培養(yǎng)基，不含水解物、蛋白、生長(zhǎng)因子及任 何動(dòng)物來源的成分，適合于各種亞型 HEK293 細(xì)胞的高密度培養(yǎng)及高效率瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。

應(yīng)用范圍 

OPM-293 CD05 即適用于科研應(yīng)用，也適用于基于細(xì)胞培養(yǎng)的大規(guī)模生物藥生產(chǎn)，但不可直接用于人體或作為藥 物使用。

儲(chǔ)存運(yùn)輸方法 

儲(chǔ)存：2~8℃冷藏，干燥避光保存 

運(yùn)輸：常溫（液體）、冷藏（干粉） 

液體培養(yǎng)基配制方法 

1. 取潔凈的配制容器，建議一次性配制體積不低于 1L；

2. 加入最終配制體積 90%的超純水或注射用水，水溫控制在 25~35°C； 

3. 稱量 19.86g/L 干粉培養(yǎng)基，緩慢加入水中攪拌 10 分鐘； 

4. 稱量 2.22g/L 碳酸氫鈉，加入水中攪拌； 

5. 緩慢加入 5N NaOH 調(diào)節(jié) pH 到 8.3~8.5，攪拌 30 分鐘，此時(shí)應(yīng)完全溶解； 

6. 緩慢加入 5N HCl 將 pH 調(diào)回至 7.0； 

7. 定容到最終配液體積，繼續(xù)攪拌 5 分鐘，測(cè) pH，用 5N NaOH 或 5N HCl 將 pH 調(diào)回至 7.0； 

8. 取樣測(cè)滲透壓，加入 NaCl 調(diào)節(jié)滲透壓至 275±10mOsm/kg（滲透壓計(jì)算公式：NaCl 添加量（g）=配液體積 （L）*（275-檢測(cè)值）/31.5）； 

9. 繼續(xù)攪拌 10 分鐘，無菌過濾到合適容器，2~8℃避光保存。

干粉及液體培養(yǎng)基質(zhì)量指標(biāo)

培養(yǎng)條件 

溫度 37℃，濕度 80%，5~8%CO2 

搖床設(shè)置：轉(zhuǎn)速 115~125rpm（振幅 50mm） 

細(xì)胞復(fù)蘇 

1. 在 37℃水浴中快速（＜2min）融化冷凍的細(xì)胞；

2. 將冷凍管中的細(xì)胞液全部轉(zhuǎn)移到含有 30mL 預(yù)溫過的 OPM-293 CD05 培養(yǎng)基的 125mL 搖瓶中； 

3. 放入 37℃，5~8% CO2，轉(zhuǎn)速 115~135rpm（振幅 50mm），濕度 80%的搖床中培養(yǎng)

細(xì)胞傳代 

1. 將 OPM-293 CD05 培養(yǎng)基放入 37℃條件下預(yù)熱 20-30min。

2. 取細(xì)胞密度≥3×10 6 ~ 4×10 6cells/mL、活率≥95%、處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期中期的細(xì)胞進(jìn)行傳代；注意：不同類 型的 HEK293 細(xì)胞可能具有不同的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期范圍。 

3. 按接種密度為 0.3×10 6 ~ 0.6×10 6cells/mL。 

4. 無菌轉(zhuǎn)移所需量的種子液至合適體積的搖瓶中，并添加所需體積的已預(yù)熱的 OPM-293 CD05 培養(yǎng)基。 

5. 將搖瓶放入溫度 37℃，濕度 80%，轉(zhuǎn)速 110-150rpm（振幅 50mm），5%~8%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)搖床中進(jìn)行培養(yǎng)。 *每 2~3 天用新鮮的培養(yǎng)基按上述步驟進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

細(xì)胞馴化 

直接接種法 

1. 對(duì)于可以直接馴化的細(xì)胞，可以從無血清培養(yǎng)基中直接接種到 OPM-293 CD05 培養(yǎng)基中，接種密度參考傳 代步驟。

2. 繼續(xù)傳代細(xì)胞，直到細(xì)胞穩(wěn)定生長(zhǎng)。 

3. 傳代幾代之后，細(xì)胞密度在接種的 3~4 天內(nèi)達(dá)到 3×10 6cells/mL、細(xì)胞活性≥95%。此時(shí)，可以認(rèn)為細(xì)胞 已被馴化成功。

梯度馴化法 

1. 如果直接馴化效果不佳，請(qǐng)嘗試按照以下梯度馴化表格進(jìn)行操作。

2. 選擇低代次的細(xì)胞，并確保細(xì)胞處于對(duì)數(shù)期。 

3. 使用原始培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，并繼續(xù)使用原始培養(yǎng)基傳代 2~3 代，以實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定的細(xì)胞生長(zhǎng)。 

4. 在完全使用 OPM-293 CD05 培養(yǎng)基接種 3~4 天之后，VCD 應(yīng)該穩(wěn)定達(dá)到 3×10 6cells/mL，細(xì)胞活性≥95%。 此時(shí)，細(xì)胞已經(jīng)馴化到 OPM-293 CD05 培養(yǎng)基中。

轉(zhuǎn)染和瞬時(shí)表達(dá) 

轉(zhuǎn)染條件應(yīng)根據(jù)具體情況進(jìn)行優(yōu)化，可能需要通過 DOE 方法確定。以下轉(zhuǎn)染條件僅供參考

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