豬藍(lán)耳熒光PCR檢測試劑盒（實(shí)時(shí)熒光PCR法）使用說明書

【產(chǎn)品名稱】
通用名稱：豬藍(lán)耳熒光PCR檢測試劑盒（實(shí)時(shí)熒光PCR法）
英文名稱： Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus Detection Kit (Real-Time PCR Method)

【包裝規(guī)格】50T/盒

【預(yù)期用途】
本試劑盒利用實(shí)時(shí)熒光PCR原理，定性檢測豬藍(lán)耳病病毒，對豬藍(lán)耳病病毒的診斷及療效評估有重要指導(dǎo)意義。

【原    理】
本試劑盒針對豬藍(lán)耳病病毒的高度保守區(qū)域設(shè)計(jì)特異性引物和探針，在反應(yīng)體系中含豬藍(lán)耳病病毒基因組模板的情況下，PCR反應(yīng)得以進(jìn)行并釋放熒光信號。利用熒光定量PCR儀對PCR過程中相應(yīng)通道信號進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測和輸出，實(shí)現(xiàn)檢測結(jié)果的定性分析。

【試劑盒組成】

序號	組成	50T/盒
1	PRRSV RT-PCR反應(yīng)液	875 μL×1管
2	PRRSV 混合酶液	125 μL×1管
3	PRRSV陽性對照	40 μL×1管
4	PRRSV陰性對照	40 μL×1管
5	說明書	1份

注：陰性對照為滅菌純水，陽性對照為含豬藍(lán)耳靶基因的質(zhì)粒。

【儲存條件及有效期】避光-20℃以下保存，避免反復(fù)凍融，有效期12個(gè)月。

【適用儀器】ABI 系列、Bio-Rad系列、Agilent Stratagene MX系列、Roche LightCycler R480、Cepheid SmartCycler、Rotor-Gene系列、杭州博日系列等多通道實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀。

【樣本要求】
1.血液或血清樣品：使用無菌注射液抽取樣品置于離心管中待檢。
2.肺臟、淋巴結(jié)和脾臟樣品：取樣本20 g，加少量滅菌PBS，用無菌研磨器研磨至糊狀，再用4倍體積的PBS稀釋成乳劑，8000 rpm 4℃離心10 min，取上清待檢。
3.應(yīng)避免標(biāo)本間交叉污染。
4.樣本收集后可立即檢測；若不能立即檢測，可置于2～8℃冷藏過夜保存；如需長期保存，標(biāo)本應(yīng)凍存于-80℃以下，避免反復(fù)凍融。。

【檢驗(yàn)方法】
1. 試劑準(zhǔn)備（試劑準(zhǔn)備區(qū)）
（1）從冰箱中取出試劑盒, 從試劑盒中取出實(shí)驗(yàn)所需試劑，充分融化混勻并瞬時(shí)離心以去除管壁附著液體。
（2）核算當(dāng)次實(shí)驗(yàn)所需要的反應(yīng)數(shù)（n），并根據(jù)如下表所示反應(yīng)體系計(jì)算當(dāng)次實(shí)驗(yàn)所需要的各種試劑量。
n =陰性對照數(shù)（1T）+陽性對照數(shù)（1T）+誤差預(yù)留量（1T）+樣本數(shù)

單反液配制表	RT-PCR反應(yīng)液	17.5 μL
	混合酶	2.5 μL

（3）在無菌離心管中加入上述試劑，充分混勻后瞬時(shí)離心。按照20μL/管分裝量將試劑分裝至PCR反應(yīng)管。
2.樣本準(zhǔn)備（樣本處理區(qū)）
用QIAGEN、Roche公司RNA提取試劑盒提取RNA，具體操作按照其試劑盒說明書操作。
3.加樣
在上述制備好的PCR反應(yīng)樣本管中分別加入處理好的待測標(biāo)本RNA各5 μL、終體積25 μL/管，蓋好PCR反應(yīng)蓋混勻后瞬時(shí)低速離心，轉(zhuǎn)移到PCR儀器上。陰性對照和陽性對照管則各加5 μL試劑盒自帶的陰性對照或陽性對照品，終體積為25 μL/管，蓋好PCR反應(yīng)蓋混勻后瞬時(shí)低速離心，轉(zhuǎn)移到PCR儀器上。
4.PCR（PCR擴(kuò)增區(qū)）
（1）取樣本處理區(qū)準(zhǔn)備好的PCR反應(yīng)管，放置在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀樣品槽相應(yīng)位置，并記錄放置順序。
（2）按下表設(shè)置儀器核酸擴(kuò)增相關(guān)參數(shù)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

反應(yīng)體積	25μL	通道選擇	FAM通道采集豬藍(lán)耳病病毒信號
PCR 反應(yīng) 條件	步驟	條件	循環(huán)數(shù)
	反轉(zhuǎn)錄	50℃：10分鐘（min）	1
	預(yù)變性	95℃：3分鐘（min）	1
	PCR擴(kuò)增	95℃：5秒（s）	40
		55℃：40秒（s） （此階段結(jié)束時(shí)采集熒光信號）

注：ABI系列熒光PCR儀在設(shè)置時(shí)不選ROX校正，設(shè)置淬滅基團(tuán)選擇None。

【參考值（參考范圍）】
1.試劑盒有效性判定：
（1）陽性對照：有典型S型擴(kuò)增曲線或Ct值≤35。
（2）陰性對照：Ct值＞38或無Ct值，線形為直線或輕微斜線，無指數(shù)增長期。
2.標(biāo)本結(jié)果判定：
（1）陽性：標(biāo)本檢測結(jié)果Ct值≤35或有明顯指數(shù)增長期。
（2）可疑：標(biāo)本檢測結(jié)果Ct值在35～38范圍內(nèi)。此時(shí)應(yīng)對標(biāo)本進(jìn)行重復(fù)檢測，如重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果Ct值仍在35～38范圍內(nèi)，有明顯指數(shù)增長期，則判定為陽性，否則為陰性。
（3）陰性：標(biāo)本檢測結(jié)果Ct值＞38或無Ct值。

【檢驗(yàn)結(jié)果的解釋】

通道及檢測結(jié)果	標(biāo)本檢測結(jié)果解釋
FAM
+	標(biāo)本中檢出豬藍(lán)耳病病毒
-	標(biāo)本中未檢出豬藍(lán)耳病病毒

【檢驗(yàn)方法的局限性】

• 當(dāng)檢測樣本中被檢核酸濃度低于本試劑盒的最低檢出限時(shí)可能會發(fā)生假陰性的結(jié)果。
• 被檢樣本在采集、運(yùn)輸、儲存以及處理過程中操作方式不當(dāng)容易造成RNA降解而產(chǎn)生假陰性結(jié)果。
• 樣本在采集、運(yùn)輸、儲存以及處理過程中發(fā)生交叉污染，則容易得到假陽性結(jié)果。

【產(chǎn)品性能指標(biāo)】產(chǎn)品的最低檢出限為10³ Copies/mL，產(chǎn)品CV值≤3%。

【注意事項(xiàng)】

• 使用本試劑盒的實(shí)驗(yàn)室，應(yīng)嚴(yán)格按照國家有關(guān)部分頒布的有關(guān)基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室管理規(guī)范進(jìn)行管理；
• 為避免RNA降解，樣本處理過程應(yīng)在0-4℃條件下操作，且完成實(shí)驗(yàn)后立即上機(jī)檢測；樣本處理過程中使用的器具耗材應(yīng)經(jīng)過無核酶處理；
• 各區(qū)域物品均為專用，不得交叉使用，以免污染；檢測結(jié)束后，應(yīng)立即對工作臺清潔；
• 吸取反應(yīng)液時(shí)，應(yīng)盡量避免產(chǎn)生氣泡；上 PCR 儀前，應(yīng)注意檢查各反應(yīng)管是否蓋緊，以免液體蒸發(fā)造成結(jié)果不準(zhǔn)確；
• 試劑盒所有試劑在使用前應(yīng)該在常溫下充分融化混勻，并應(yīng)瞬時(shí)離心；
• 試劑盒內(nèi)所配陰性和陽性對照在第一次使用前應(yīng)全部轉(zhuǎn)移至標(biāo)本準(zhǔn)備區(qū)，并單獨(dú)存放；
• 為防止熒光干擾，應(yīng)避免裸手直接接觸PCR反應(yīng)管，并應(yīng)避免在PCR反應(yīng)管上進(jìn)行任何標(biāo)記；
• 檢測過程中使用過的吸頭，應(yīng)直接打到盛有 10%次氯酸的廢物缸內(nèi)，檢測結(jié)束的PCR 反應(yīng)管，切忌開蓋，并與其他廢棄物品一同滅菌后丟棄；工作臺及各種實(shí)驗(yàn)用品應(yīng)定期用 10%次氯酸、75%酒精或紫外燈進(jìn)行消毒；
• 儀器擴(kuò)增相關(guān)參數(shù)應(yīng)按照本說明書相關(guān)要求進(jìn)行設(shè)置；不同批號試劑不能混用；并在有效期內(nèi)使用。