物理模型助力鐵死亡引發(fā)大規(guī)模細(xì)胞死亡原因研究

鐵死亡的熱度自不必多言， 近期，中研院分生所陳升宏課題組在 Nature 發(fā)表了研究，發(fā)現(xiàn)鐵死亡觸發(fā)波可導(dǎo)致大規(guī)模細(xì)胞死亡…… 

01
背景知識：觸發(fā)波與 FHN 模型

動(dòng)感光波，biu biu biu？NO！是觸發(fā)波！��！ 

多細(xì)胞生物有時(shí)需要在遠(yuǎn)距離上快速協(xié)調(diào)行為�？瓤�，說人話……For Example！  經(jīng)歷戰(zhàn)斗或逃跑反應(yīng)的人類會(huì)在數(shù)秒內(nèi)心率加快、瞳孔擴(kuò)張、外周血管收縮。但這種情況是無法通過擴(kuò)散、微管運(yùn)輸、流動(dòng)等通信方式實(shí)現(xiàn)的。

So，觸發(fā)波，一種反復(fù)出現(xiàn)的生物現(xiàn)象，在傳播過程中不會(huì)減慢或失去振幅，可快速可靠地遠(yuǎn)距離傳輸信息。

觸發(fā)波：舉個(gè)栗子！

首先，最古老的生物觸發(fā)波——動(dòng)作電位。

動(dòng)作電位起源于軸突小丘 (圖 1a) 并以不減的速度和幅度沿軸突傳播 (圖 1b)。動(dòng)作電位產(chǎn)生和傳播的關(guān)鍵蛋白質(zhì)是電壓敏感的鈉通道 (圖 1c)。

其電路是一個(gè)相互關(guān)聯(lián)的正反饋和負(fù)反饋回路系統(tǒng)。反饋回路在蛋白質(zhì)構(gòu)象變化和離子流的水平上運(yùn)行，這兩個(gè)過程都是非�？焖俚倪^程，這使得動(dòng)作電位的峰值可以在不到 1 毫秒的時(shí)間內(nèi)達(dá)到[1]。

圖 1. 生物觸發(fā)波的示例^[1]。

 

(a–c）動(dòng)作電位。(a) 動(dòng)作電位在軸突小丘處產(chǎn)生，并沿軸突向遠(yuǎn)端傳播。(b) 通過一系列細(xì)胞外電極測量沿軸突傳播的動(dòng)作電位記錄。動(dòng)作電位期間 Na⁺ 向內(nèi)流動(dòng)記錄為細(xì)胞外電極記錄的電位負(fù)偏轉(zhuǎn)。(c) 產(chǎn)生動(dòng)作電位的電路示意圖。(d–f) 受精卵中的鈣波。(d) 鈣波在精子入口處產(chǎn)生并擴(kuò)散到整個(gè)卵子中。(e) 通過鈣綠加載后的比率成像測量乳狀帶蟲 Cerebratulus lacteus 母細(xì)胞中鈣濃度隨時(shí)間的變化。(f) 產(chǎn)生鈣波的電路示意圖。（g-i）非洲爪蟾卵中的有絲分裂波。（g）受精和受精后鈣波約 1 小時(shí)后，Cdk1 激活波從著絲粒附近擴(kuò)散到細(xì)胞皮層。（h）非洲爪蟾卵提取物中的有絲分裂波。薄薄的聚四氟乙烯管中裝滿了循環(huán)的非洲爪蟾卵提取物以及精子染色質(zhì)和核定位信號--綠色熒光蛋白標(biāo)記。核膜破裂波從細(xì)胞質(zhì)中最快的區(qū)域 (靠近這部分管的中間) 向外擴(kuò)散。（i）產(chǎn)生細(xì)胞周期蛋白 B-Cdk1 激活波的電路示意圖。

  
當(dāng)然，除了沿神經(jīng)元軸突傳播的動(dòng)作電位外，典型的例子還包括各種組織中的鈣波以及非洲爪蟾卵中的有絲分裂波。

雖然這三種情況下所涉及的蛋白質(zhì)是互不相關(guān)的，但其輸出 (膜去極化、細(xì)胞內(nèi) Ca2+ 或細(xì)胞周期蛋白 B-Cdk1 活性) 都會(huì)通過觸發(fā)波在空間和時(shí)間中傳播。

動(dòng)作電位：質(zhì)膜去極化——電壓敏感鈉通道開放——鈉沿著其濃度和電位梯度向內(nèi)涌入——膜進(jìn)一步去極化，這構(gòu)成了一個(gè)正反饋回路（圖 1C)。動(dòng)作電位由兩個(gè)過程終止：電壓敏感性鉀通道的延遲開放，允許 K⁺ 流出細(xì)胞并恢復(fù)細(xì)胞內(nèi)的凈負(fù)電荷，以及電壓依賴性鈉通道的自身失活（圖 1C)。

鈣波：與動(dòng)作電位一樣，鈣波是由具有正反饋的電路產(chǎn)生的（圖 1F)。在這種情況下，細(xì)胞內(nèi)游離 Ca²⁺ 的增加激活磷脂酶 C (PLC)，后者裂解磷脂酰肌醇 4,5 二磷酸 (PIP 2) 并生成第二信使肌醇三磷酸 (IP 3)。然后，IP 3 與充滿鈣的內(nèi)質(zhì)網(wǎng) (ER) 上的 IP 3 受體 (IP 3 R) 結(jié)合，使 Ca²⁺ 流入細(xì)胞質(zhì)并進(jìn)一步激活 PLC（圖 1F)。因此，細(xì)胞內(nèi)鈣離子的增加會(huì)引起細(xì)胞內(nèi)鈣離子的進(jìn)一步增加。此外，細(xì)胞內(nèi)鈣離子通過調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的 IP 3 受體和阿諾定受體（Ryanodine receptor），更直接地刺激內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣離子的釋放。因此，有兩個(gè)相互關(guān)聯(lián)的正反饋回路在相似的時(shí)間尺度上起作用。細(xì)胞內(nèi)鈣離子的增加受到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)有限容量的限制，然后被膜結(jié)合鈣泵逆轉(zhuǎn)，構(gòu)成負(fù)反饋回路（圖 1F)。

有絲分裂波：產(chǎn)生有絲分裂波的電路如圖所示圖 1I。該過程以細(xì)胞周期蛋白 B-細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶 1 (Cdk1) 復(fù)合物為中心，后者是有絲分裂的主要調(diào)節(jié)器。蛋白激酶 Cdk1 又受快速、相互關(guān)聯(lián)的正反饋和雙負(fù)反饋回路調(diào)控 （Cdk1 激活其激活劑 Cdc25C 并使其滅活劑 Wee1 失活)，從而構(gòu)成雙穩(wěn)態(tài)開關(guān)。然后，該開關(guān)由時(shí)間延遲的負(fù)反饋回路關(guān)閉；Cdk1 激活 APC/C Cdc20 復(fù)合物，這是一種泛素 E3 連接酶，可促進(jìn)細(xì)胞周期蛋白 B 降解并使系統(tǒng)恢復(fù)到低 Cdk1 活性狀態(tài)。

物理助攻：FHN 模型

FitzHugh-Nagumo (FHN) 模型，一組物理學(xué)家熟知的方程。FHN 方程最初是作為 Hodgkin-Huxley 動(dòng)作電位模型的簡化提出的，可看作是相互關(guān)聯(lián)的正負(fù)反饋回路的簡單通用模型，可以產(chǎn)生各種類型的動(dòng)態(tài)響應(yīng)，包括開關(guān)、脈沖和振蕩。此外，通過在 FHN 模型中添加擴(kuò)散，可以產(chǎn)生觸發(fā)波，這些觸發(fā)波可快速傳播這些開關(guān)、脈沖和振蕩到很遠(yuǎn)的距離。

此外，F(xiàn)HN 模型可以表現(xiàn)出三種類型的行為：雙穩(wěn)態(tài) (Bistability)、興奮性 (Excitability) 和振蕩 (Oscillations)。當(dāng)與擴(kuò)散等空間耦合機(jī)制相結(jié)合時(shí)，這些響應(yīng)中的每一個(gè)都可以作為觸發(fā)波傳播[1]。  

02
鐵死亡再登 Nature



言歸正傳！近期，Nature 發(fā)表了題為：Emergence of large-scale cell death through ferroptotic trigger waves  的研究論文。該研究證明：鐵死亡，一種依賴于鐵和脂質(zhì)過氧化的細(xì)胞死亡形式，可以通過活性氧 (ROS) 觸發(fā)波在人體細(xì)胞中以恒定速度（約 5.5 μm/min）長距離傳播 (≥ 5 mm)，由此引發(fā)大規(guī)模細(xì)胞死亡[2]。  

主要內(nèi)容：
1. 鐵死亡可以通過活性氧 (ROS) 觸發(fā)波在人體細(xì)胞中以恒定速度 (約 5.5 μm/ min) 長距離傳播 (≥5 mm)。
2. ROS 反饋回路 (Fenton 反應(yīng)、NADPH 氧化酶信號傳導(dǎo)和谷胱甘肽合成) 在控制鐵死亡觸發(fā)波進(jìn)展中起主要作用。
3. 研究表明，通過抑制胱氨酸吸收引入鐵死亡應(yīng)激可激活這些 ROS 反饋回路，將細(xì)胞氧化還原系統(tǒng)從單穩(wěn)態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)殡p穩(wěn)態(tài)，從而使細(xì)胞群成為 ROS 傳播的雙穩(wěn)態(tài)介質(zhì)。
4. 此外，鐵死亡及其傳播伴隨著胚胎鳥類肢體肌肉重塑過程中大量但空間受限的細(xì)胞死亡事件，證實(shí)了其在胚胎發(fā)生過程中用作組織塑造策略。

本篇文獻(xiàn)使用 MCE 產(chǎn)品如下：

RLS-3 (HY-100218A)	鐵死亡誘導(dǎo)劑
Staurosporine (HY-15141)	鐵死亡誘導(dǎo)劑
GKT137831 (HY-12298)	NOX1/NOX4 抑制劑
Trolox (HY-101445)	ROS 清除劑

 

鐵死亡以觸發(fā)波的形式傳播

研究者使用了 RPE 細(xì)胞，其對藍(lán)光照射敏感，并在對年齡相關(guān)性視網(wǎng)膜變性期間表現(xiàn)出過度的鐵死亡。作者使用 MCE 鐵死亡誘導(dǎo)劑如 RSL3 (HY-100218A) 或 Staurosporine (HY-15141)處理后，鐵死亡開始并在 RPE 細(xì)胞中傳播。

圖 2. 鐵死亡在不同細(xì)胞類型中傳播^[2]。

RSL3 (0.15 μM) (a) 或 Staurosporine (0.15 μM) (b) 處理的 RPE-1 細(xì)胞中細(xì)胞死亡的延時(shí)圖像。顯示為明場和核染料熒光圖像與細(xì)胞死亡輪廓（橙色輪廓）疊加。

藍(lán)光照射會(huì)升高細(xì)胞 ROS，并促使經(jīng) Erastin  處理的 RPE 細(xì)胞隨后死亡。作者用藍(lán)光照射 Erastin 處理的細(xì)胞后，鐵死亡從光照區(qū)域開始，并以 5.52 ± 0.09 µm/min（平均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)差）的恒定速度在 ≥5 mm 的距離內(nèi)傳播。

圖 3. 鐵死亡通過脂質(zhì)過氧化前以恒定速度在 RPE-1 細(xì)胞中傳播^[2]。

 

a-b. 鐵死亡從光誘導(dǎo)區(qū)域（紅色圓圈）開始，并在 18 小時(shí)內(nèi)傳播至 5 毫米內(nèi)經(jīng) Erastin 處理的細(xì)胞。輪廓（白色輪廓）表示特定時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞死亡的邊界。a. 核染料熒光圖像（光誘導(dǎo)后 11 小時(shí)）與光誘導(dǎo)后 2-18 小時(shí)的輪廓疊加。b. 光誘導(dǎo)后細(xì)胞死亡的延時(shí)圖像，顯示 a 中橙色框的放大視圖。細(xì)胞破裂（明場）和核染料熒光增加（青色至白色）表示細(xì)胞死亡。c-d：數(shù)據(jù)來自 a，c：鐵死亡傳播的延時(shí)圖像陣列。d：鐵死亡傳播的動(dòng)態(tài)圖。

 鐵死亡的一個(gè)標(biāo)志是脂質(zhì)過氧化的升高。作者使用脂質(zhì)過氧化探針和通用 ROS 探針檢測羥基自由基 (•OH)、超氧化物 (O₂-) 和過氧化氫 (H₂O₂-) 均觀察到波長 (圖中 3a-b)，細(xì)胞 ROS（•OH、O2- 和 H₂O₂）波前先于鐵死亡傳播，且以類似于鐵死亡波的速度傳播。這表明鐵死亡通過觸發(fā)波而非簡單擴(kuò)散進(jìn)行傳播。此外，作者通過添加 MCE ROS 清除劑 Trolox (HY-101445)，發(fā)現(xiàn)其可阻止細(xì)胞死亡的傳播 (圖 4c)，這表明多種 ROS 可以共同促進(jìn)驅(qū)動(dòng)鐵死亡傳播的信號波前。
 

圖 4. 多種 ROS 可以共同促進(jìn)驅(qū)動(dòng)鐵死亡傳播的信號波前^[2]。

 

a-b. 脂質(zhì)過氧化 (黃色) 和核染料熒光 (青色) 的合并圖像。使用 C11-BODIPY 581/591 監(jiān)測脂質(zhì)過氧化。黃色輪廓表示特定時(shí)間點(diǎn)脂質(zhì)過氧化的邊界。a. 圖像 (光誘導(dǎo)后 7 小時(shí)) 與光誘導(dǎo)后 1-10 小時(shí)的輪廓疊加 (頂部)。底部，圖像底部區(qū)域量化的細(xì)胞死亡和脂質(zhì)過氧化的熒光強(qiáng)度。b. a 中盒子的放大視圖。c. 在光誘導(dǎo) 4 小時(shí)后添加 ROS 清除劑如 MCE Trolox (6 µM) 后，Erastin 處理的細(xì)胞中細(xì)胞死亡傳播的動(dòng)態(tài)圖 (白色箭頭)^[2]。

傳播機(jī)制

ROS 波前的形成需要兩個(gè)關(guān)鍵要素：(1) 細(xì)胞間 ROS 傳輸?shù)目臻g耦合機(jī)制；(2) 細(xì)胞內(nèi) ROS 擴(kuò)增機(jī)制 (例如，ROS 雙穩(wěn)態(tài))。作者驗(yàn)證了 ROS 或 ROS 誘導(dǎo)分子的擴(kuò)散不依賴于細(xì)胞與細(xì)胞之間的直接接觸。且在波停止的情況下，非起始區(qū)域邊緣的細(xì)胞表現(xiàn)出 ROS 積累 (圖 5)，推測可能是由來自波起始區(qū)域的鐵死亡細(xì)胞的擴(kuò)散分子引起的。

通過實(shí)驗(yàn)，研究者發(fā)現(xiàn)這些擴(kuò)散分子可能是一類 ROS，且不太可能是 H₂O₂，更可能是過氧化脂質(zhì)或其副產(chǎn)物。需要進(jìn)一步研究來確定這些擴(kuò)散 ROS 分子的身份。

圖 5. ROS 信號的擴(kuò)散作為鐵死亡觸發(fā)波的耦合機(jī)制^[2]。

 

a. 在波起始區(qū)域 (左) 和非起始區(qū)域 (右) 之間產(chǎn)生間隙。細(xì)胞死亡 (青色) 和 ROS (黃色) 跨間隙傳播的延時(shí)圖像序列。使用 CellROX 染料監(jiān)測 Erastin 處理的細(xì)胞中的 ROS。在特定時(shí)間點(diǎn)沿 2 mm 距離量化 ROS 的平均熒光強(qiáng)度。b. 波穿過不同間隙寬度 (35-380 微米) 的概率。

  
鐵死亡的傳播需要細(xì)胞間的 ROS 傳遞和細(xì)胞內(nèi)的 ROS 放大，進(jìn)而導(dǎo)致它們進(jìn)一步產(chǎn)生擴(kuò)散性 ROS 和鐵死亡細(xì)胞死亡。

至少有三個(gè) ROS 反饋回路可能起作用以擴(kuò)增鐵死亡網(wǎng)絡(luò)中的 ROS：谷胱甘肽 (GSH) 介導(dǎo)的雙負(fù)反饋回路和 Fenton 反應(yīng) 32 和 NADPH 氧化酶 (NOX) 信號傳導(dǎo)的兩個(gè)正反饋回路 (圖 6a)。

為了研究這些反饋回路在調(diào)節(jié)鐵死亡傳播中的作用，作者通過化學(xué)擾動(dòng)調(diào)節(jié)了它們的強(qiáng)度 (圖 6b)。
 

圖 6. ROS 反饋回路及化學(xué)干擾示意圖^[2]。 

芬頓反應(yīng)由細(xì)胞中游離鐵驅(qū)動(dòng)。它將 H₂O₂ 轉(zhuǎn)化為 •OH——一種高活性 ROS，可引發(fā)自催化脂質(zhì)過氧化。使用鐵螯合劑去鐵胺 (Deferoxamine，DFO) 和鐵補(bǔ)充劑檸檬酸鐵 (Ferric citrate，F(xiàn)C) 擾亂了鐵水平。經(jīng) DFO 處理（80 µM）后，我們觀察到鐵死亡傳播速度降低。相比之下，通過 FC 提供游離鐵可加速鐵死亡傳播 (圖 7)。

圖 7. 化學(xué)干擾劑的核染料熒光圖像及對鐵死亡觸發(fā)波的影響。 

 

a．核染料熒光圖像 (光誘導(dǎo)后 11 h) 與細(xì)胞死亡輪廓疊加。黃色輪廓表示添加 DFO (80 µM) 的時(shí)間點(diǎn)。b.  核染料熒光圖像 (光誘導(dǎo)后 15 h) 與細(xì)胞死亡輪廓疊加。黃色輪廓表示添加 FC (250 µM) 的時(shí)間點(diǎn)。c-d. 添加鐵后，鐵死亡觸發(fā)波的速度增加。c.a 中實(shí)驗(yàn)的動(dòng)態(tài)圖。d. b 中實(shí)驗(yàn)的動(dòng)態(tài)圖。波速與DFO (e)、FC (f) 濃度的關(guān)系。

  
NOX 是產(chǎn)生細(xì)胞 ROS（O₂-和 H₂O₂）的主要酶類，活性酪氨酸激酶及其下游效應(yīng)物 (如 PI3K) 可以激活 NOX 以進(jìn)一步促進(jìn) ROS 生成。作者使用 MCE NOX1/NOX4 抑制劑 GKT137831 (HY-12298) 等三種抑制劑處理 RPE 細(xì)胞 (圖6b)，均減緩了鐵死亡的傳播 (圖 8a-c)，并呈現(xiàn)出劑量依賴性 (圖 8d-f)。
 

圖 8. MCE NOX1/NOX4 抑制劑 GKT137831 (HY-12298) 等對鐵死亡傳播的影響。

a-c. 添加 GKT137831 (1.25 µM)、LY294002  (100 µM) 或 Dasatinib (0.6 µM) 可減緩鐵死亡觸發(fā)波。d-f，波速與 GKT137831、LY294002 和 Dasatinib 濃度的關(guān)系。

 

除了化學(xué)干擾外，作者還通過過度表達(dá) ERK2 來基因調(diào)節(jié) NOX 信號的強(qiáng)度，鐵死亡波在 ERK2 過度表達(dá)的細(xì)胞中以更高的速度傳播，表明‍ NOX 介導(dǎo)的反饋回路在波傳播中起主要作用。‍

最后，作者建立了一個(gè) ROS 觸發(fā)波的數(shù)學(xué)模型，該模型結(jié)合了 (1) 鐵死亡網(wǎng)絡(luò)中細(xì)胞內(nèi)在的 ROS 反饋回路；和 (2) 簡單擴(kuò)散作為細(xì)胞間的耦合機(jī)制。結(jié)果表明，Erastin 濃度的增加會(huì)導(dǎo)致 ROS 穩(wěn)態(tài)的變化，即從單穩(wěn)態(tài)轉(zhuǎn)換為雙穩(wěn)態(tài)。ROS 通常在這種雙穩(wěn)態(tài)范圍內(nèi)以觸發(fā)波的形式傳播，進(jìn)而加速鐵死亡傳播 (圖 9)。

圖 9. 鐵死亡應(yīng)激使細(xì)胞啟動(dòng) ROS 雙穩(wěn)態(tài)，并促進(jìn)鐵質(zhì)觸發(fā)波的傳播^[2]。

 

a、計(jì)算機(jī)模擬顯示 ROS 穩(wěn)態(tài)與 erastin 濃度的關(guān)系。隨著 erastin 濃度的增加，ROS 穩(wěn)態(tài)從單穩(wěn)態(tài) (低) 分為雙穩(wěn)態(tài) (黃色區(qū)域)。穩(wěn)定的低和高 ROS 穩(wěn)態(tài)和 USS 分別用藍(lán)色、紅色和白色圓圈表示。光誘導(dǎo)引起的 ROS 升高 (藍(lán)色箭頭，從藍(lán)色圓圈升高到黃色圓圈) 使細(xì)胞超過 USS，高于 USS 時(shí) ROS 被放大（紅色箭頭）到高穩(wěn)態(tài)。b、在不同 Erastin 濃度下光誘導(dǎo) 20 分鐘后的 ROS 熒光圖像 (黃色)。c. 增加 Erastin 濃度會(huì)促進(jìn) ROS 波前傳播。光誘導(dǎo) 6 小時(shí)后用不同濃度 Erastin 處理的細(xì)胞群中 ROS 傳播的模擬 (頂部) 和實(shí)驗(yàn) (底部)。

產(chǎn)品推薦

Setanaxib Setanaxib 是選擇性的 NADPH 氧化酶 (NOX1/4) 抑制劑，NADPH 的代謝情況與鐵死亡關(guān)系緊密。

RSL3 RSL3 ((1S,3R)-RSL3) 是一種谷胱甘肽過氧化物酶 4 (GPX4) 的抑制劑 (ferroptosis 激動(dòng)劑)。

L-BSO L-Buthionine-(S,R)-sulfoximine 是一種 G-谷氨酸半胱氨酸合成酶抑制劑，通過消耗 GSH 誘導(dǎo)細(xì)胞中的氧化應(yīng)激。

Ferrozine Ferrozine 是一種分光光度法測定鐵的試劑，能與二價(jià)鐵反應(yīng)形成穩(wěn)定的品紅絡(luò)合物。該復(fù)合物在 562 nm 處有吸收峰。

RhoNox-1 RhoNox-1 是一種特異性檢測二價(jià)鐵離子的熒光探針，當(dāng) RhoNox-1 與 Fe2+ 反應(yīng)后，可以生成一種不可逆的紅色熒光產(chǎn)物。

LPd peroxida probe LPd peroxida probe 將脂質(zhì)氫過氧化物還原為脂質(zhì)醇，可以用于對活細(xì)胞中的脂質(zhì)氫過氧化物進(jìn)行成像。

PGSK Phen green SK (PGSK) diacetate 是一種熒光重金屬指示劑，可以對二價(jià)鐵離子進(jìn)行檢測。

BODIPY 581/591 C11  ODIPY 581/591 C11 常用于活細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化和抗氧化性能的研究，或與羥基自由基反應(yīng)、檢測鐵死亡 (ferroptosis)。

H2DCFDA 經(jīng)典的 ROS 檢測探針，可以很好的反饋細(xì)胞內(nèi) ROS 水平。

MitoSOX Red MitoSOX Red 是一種超氧化物指示劑，進(jìn)入細(xì)胞后被激活，產(chǎn)品明亮的紅色熒光 。

 

參考文獻(xiàn)：
[1] Gelens L, et al. Spatial trigger waves: positive feedback gets you a long way. Mol Biol Cell. 2014 Nov 5;25(22):3486-93. 
[2] Co, H.K.C., et al. Emergence of large-scale cell death through ferroptotic trigger waves. Nature 631, 654–662 (2024).