結直腸癌相關成纖維細胞通過NECTIN2信號抑制效應T細胞
Colorectal cancer-associated fibroblasts inhibit effector T cells via NECTIN2 signaling
Keywords: Cancer-associated fibroblasts; Colorectal cancer; Fibroblast heterogeneity; NECTIN2; TinCAFs.
結直腸癌（CRC）是最常見和最致命的癌癥之一。CRC具有異質性腫瘤微環(huán)境，具有獨特的成纖維細胞群。腫瘤生長和進展的過程與腫瘤相關成纖維細胞（CAF）有關。據(jù)報道，CAF調節(jié)炎癥細胞的募集，并影響血管生成、腫瘤干性和耐藥性。因此，CAF在很大程度上促進了癌癥的進展，被認為是治療的重要靶點。
盡管在胰腺導管腺癌、乳腺癌和肺癌中對CAF的表征方面取得了進展，但仍缺乏對結直腸癌CAF的全面分析。研究已經報道了兩種主要的CAF亞型，它們要么表達細胞外基質（ECM）分子和調節(jié)劑（稱為CAF-A），要么表達肌成纖維細胞的標志物（稱為CAF-B）。此外，CRC CAF特征與預后不良相關。然而，由于以往的研究主要集中在分析CRC的整體細胞組成上，因此對CAF亞型的廣泛分析受到測序CAF數(shù)量相對較少的阻礙。CAF在CRC中起著核心作用，目前仍缺乏對CAF異質性的全面分析。
最近，在德國哥廷根大學醫(yī)學中心的一項研究中，通過結合單細胞RNA測序（scRNA seq）和空間蛋白質組學，對人類結腸和CRC組織樣本中的成纖維細胞異質性進行了深入分析，發(fā)現(xiàn)并命名了一種新的亞型TinCAF，證明了 TinCAF 特征標志物的高表達與 CRC 患者的無復發(fā)生存期縮短有關。這種新發(fā)現(xiàn)的CAF可能代表了未來CRC免疫療法的潛在靶點。研究成果發(fā)表在 Cancer Letters 期刊題為“Colorectal cancer-associated fibroblasts inhibit effector T cells via NECTIN2 signaling”。
首先，研究人員全面分析了成纖維細胞的異質性，通過對8個不同樣本（6個CRC樣本，2個正常結腸樣本）進行scRNA-seq（圖1 A、B），發(fā)現(xiàn)成纖維細胞聚集成了11個不同的簇（圖1 C）。有趣的是，大多數(shù)簇在正常樣本和CRC組織中都被發(fā)現(xiàn)（圖1 D），然而，簇3、5、7 和 9 幾乎只存在于 CRC 組織中，因此代表了 CAF 特異性簇。
基于對差異表達標記基因的分析，已知的成纖維細胞亞型，如apCAF（簇1）、“上皮維持”成纖維細胞（簇2）、myCAF（簇3）和 iCAF（簇7）被鑒定出來（圖1 E）。簇9 顯示 MKI67、CENPF、CDK1 和其他細胞周期相關基因的高表達，表明該簇為增殖成纖維細胞的區(qū)室。簇5 不表達已知的 CAF 特征標記物，但顯示出免疫相關基因的表達，如CD40、CD276和NECTIN2（圖1 E）。這證明了人類正常結腸組織和CRC組織中的成纖維細胞異質性，揭示了已知的CAF亞型，但鑒定了一種新的CAF簇。
為了進一步分析簇5 及其潛在的功能特征，利用基因集富集分析（GSEA），發(fā)現(xiàn)其中富集的基因集與干擾素反應和氧化磷酸化相關，表明這些 CAF 具有免疫反應和代謝活性（圖 1 F）。進一步評估差異表達基因，注意到與免疫調節(jié)相關的其他基因，如 CD39、CD59、CAV1、MIF 和 Notch3（圖1 G）。這些數(shù)據(jù)說明，簇5 成纖維細胞與癌癥相關，但與已知的 CAF 亞群不同，并顯示出免疫調節(jié)基因表達譜。
當比較同一患者CRC 成纖維細胞和正常組織中簇-特征標志物的蛋白質表達水平時，發(fā)現(xiàn)了差異表達，證實了成纖維細胞的異質性和蛋白質組學水平上的 CAF 特異性特征。由于新發(fā)現(xiàn)的簇5 特別令人感興趣，研究人員更仔細地分析了簇5 蛋白標記物NECTIN2（CD112）的表達，發(fā)現(xiàn)NECTIN2表達僅在腫瘤微環(huán)境中發(fā)現(xiàn)，主要與表達CD90的成纖維細胞亞群共定位，但不在上皮腫瘤細胞上表達。
圖1 結直腸癌和結腸成纖維細胞的轉錄組異質性。
由于簇5 與免疫細胞和 T 細胞相互作用性狀相關，因此，實驗接下來分析了 CAF 標記蛋白與 T 細胞相關的表達模式。結果表明，所有CAF相關標志物在接近T細胞的成纖維細胞中的表達水平均顯著升高。這些發(fā)現(xiàn)指出了T細胞和CAF之間的密切相互作用，并暗示了T細胞可能影響TME中某些CAF的募集和分布的可能性。
空間蛋白質組學分析表明，CAF和腫瘤浸潤性T細胞之間存在密切的相互作用。因此，使用共培養(yǎng)試驗評估了結直腸癌衍生的 CAF 對 T 細胞的影響。首先，使用流式細胞術在不同患者的原代CAF培養(yǎng)物中檢測到簇5 CAF的6個特征蛋白標記物（圖2 A、B），并證實了共表達（圖2 C），表明簇5 CAF的表型在原代培養(yǎng)物中得以維持。
然后將原代 CAF 與 T 細胞共培養(yǎng)三天以表征 CAF 和 T 細胞之間的相互作用（圖2 D）。盡管在整個共培養(yǎng)過程中不斷刺激 T 細胞，但 CAF 顯著降低了 T 細胞活力和增殖，證明了 CRC CAF 對 T 細胞的抑制特性（圖2 E）。CD4 輔助性T 細胞顯示 CD69 和 TIM-3 表達增加，其他測試標志物沒有顯示出明顯的趨勢（圖2 F）。在 CD8 細胞毒性T 細胞中，CD69 和 TIM-3 在 CAF 存在下也顯著上調。然而，CD25、CD137 和 PD-1 顯著下調（圖2 F）。這些數(shù)據(jù)表明，CAF可以在體外破壞T細胞的活化并抑制其增殖。
此外，分析了共培養(yǎng)后的 CAF 表型以評估直接 T 細胞相互作用引起的可能調節(jié)。值得注意的是，CAF 在共培養(yǎng)的三天內顯著上調了 VCAM1 以及簇5 特異性 CAF 蛋白標記物 NECTIN2 和 CD40（圖2 G），表明 T 細胞可以直接調節(jié) CAF 的表型，正如空間蛋白質組學所揭示的那樣。CD40 是 T 細胞活化標志物 CD154（CD40L）的受體，而 NECTIN2 可以結合 T 細胞表達的多種受體，表明簇5 CAF 直接參與 CRC 中 T 細胞反應的協(xié)調。
圖2 CAF-T細胞相互作用的功能分析。
實驗假設 CRC CAF 可以通過上調簇5 蛋白標志物 NECTIN2 和 CD40 來抑制 T 細胞增殖和活化。為了研究這些標記物的作用，在共培養(yǎng)實驗中應用了阻斷受體-配體結合的功能性抗體。在T細胞激活后，大多數(shù)T細胞獲得了效應記憶或效應記憶重新表達 CD45RA 表型，而只有 20-30% 的 T 細胞表現(xiàn)出幼稚表型（圖3 A）。與CAF的直接相互作用顯著降低了T+ EM 的豐度和 TEMRA 細胞，而大約 60-80% 的 T 細胞保留在幼稚 T 細胞狀態(tài)。此外，在抗體介導的阻斷是NECTIN2而不是CD40時，CAF的抑制作用被完全消除。
對與CAF共培養(yǎng)的T細胞的活化和損耗標志物表達的分析顯示出異常表型（圖3 B）：與單獨使用T細胞相比，活化和耗竭標志物均增加。相比之下，CD40 和更明顯的NECTIN2阻斷顯著降低了 CD25、TIM-3、LAG3 和 PD1 的表達，表明這兩種 CAF 標志物都是抑制作用所必需的。在CD8 T細胞中，NECTIN2阻斷的作用更為明顯，表明NECTIN2是CD8 T細胞耗竭的關鍵調節(jié)因子。雖然阻斷NECTIN2對T細胞活化和分化有顯著影響，但NECTIN2受體的表達不受影響，這表明對T細胞的影響確實主要由NECTIN2介導。
最后，為了研究簇5 CAF特異性基因表達的臨床相關性，研究人員在1342例結腸癌患者的公開臨床數(shù)據(jù)庫中評估了NECTIN2、CD40和CD248的表達，發(fā)現(xiàn)NECTIN2高表達患者的預后明顯差于低NECTIN2表達的患者。同樣，CD40 或CD248的高表達也是該患者隊列中的不良預后因素。此外，NECTIN2、CD40 和 CD248 的高表達僅在 158 例微衛(wèi)星穩(wěn)定型（MSS）患者中與無復發(fā)生存期（RFS）的顯著降低相關，而在微衛(wèi)星不穩(wěn)定型（MSI）高表達患者中不相關。
鑒于簇5 CAF 標志物NECTIN2的顯著預后價值，實驗測試了其表達與其他腫瘤實體臨床結果的相關性，結果證實了在乳腺癌、肺腺癌、胃癌以及急性髓系白血病和多發(fā)性骨髓瘤中，高NECTIN2表達是患者預后不良的因素。這些數(shù)據(jù)強調了NECTIN2作為免疫治療潛在靶點的臨床相關性和預后價值。
圖3 阻斷 CD40 或 NECTIN2 調節(jié)共培養(yǎng)后的 T 細胞表型和耗竭。
圖4 研究對人類結直腸癌和結直腸癌患者正常結腸組織中的成纖維細胞異質性進行了全面分析，確定了11個成纖維細胞亞群（圖4 a）。其中，發(fā)現(xiàn)了先前描述的亞群，例如myCAF-樣，iCAF-樣，apCAF-樣和“上皮維持”成纖維細胞。四個亞群幾乎只存在于 CRC 組織中，因此代表了 CRC CAF。研究鑒定了一種新的 CAF 亞群，基于其 T 細胞抑制和耗竭誘導特征，將其命名為 T 細胞抑制性 CAF（TinCAF）（圖4 b）。
綜上所述，該研究認為這種新型NECTIN2-陽性CAF亞型是抑制TME的重要參與者，也是下一代免疫檢查點抑制劑的潛在新靶點。這些抑制劑可能是一個有價值的選擇，特別是在MSS腫瘤中。
參考文獻：Agorku DJ, Bosio A, Alves F, Ströbel P, Hardt O. Colorectal cancer-associated fibroblasts inhibit effector T cells via NECTIN2 signaling. Cancer Lett. 2024 Jul 28;595:216985. doi: 10.1016/j.canlet.2024.216985. Epub 2024 May 29. PMID: 38821255.
原文鏈接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38821255/
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