文獻(xiàn)解讀：DNA甲基化保護(hù)早期胚胎線粒體基因組穩(wěn)定性
大家好，這里是專注表觀組學(xué)十余年，領(lǐng)跑多組學(xué)科研服務(wù)的易基因。
在早期哺乳動(dòng)物胚胎中，線粒體氧化代謝增強(qiáng)是著床后生存和發(fā)育的重要特征；著床前期的線粒體重塑是正常胚胎發(fā)生的關(guān)鍵事件。在這些變化中，氧化磷酸化（OXPHOS）增強(qiáng)對(duì)于支持著床后胚胎的高能量需求至關(guān)重要，但線粒體氧化代謝的增強(qiáng)，同時(shí)也導(dǎo)致線粒體內(nèi)大量ROS的積累，由此產(chǎn)生的線粒體氧化應(yīng)激會(huì)破壞早期胚胎線粒體DNA（mtDNA）穩(wěn)定性。在圍植入期，盡管多種抗氧化機(jī)制會(huì)被激活以清除細(xì)胞內(nèi)大量的ROS，但線粒體內(nèi)部是否存在對(duì)抗氧化應(yīng)激的自我保護(hù)機(jī)制，一直都不清楚。同時(shí)線粒體基因組在此過程中發(fā)生DNA甲基化，它與線粒體應(yīng)激增強(qiáng)的時(shí)空重合，那mtDNA甲基化是否在維持線粒體基因組穩(wěn)定性方面發(fā)揮作用呢？
近期，中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院動(dòng)物繁殖與發(fā)育科學(xué)系岳媛博士和任立坤博士為論文共同第一作者、田見暉教授和安磊教授為論文共同通訊在美國科學(xué)院院刊（PNAS）正式發(fā)表了題為“Mitochondrial genome undergoes de novo DNA methylation that protects mtDNA against oxidative damage during the peri-implantation window“的研究論文，研究揭示了早期胚胎通過線粒體DNA de novo甲基化（de novo mtDNA methylation）保護(hù)線粒體基因組穩(wěn)定性的全新機(jī)制。
標(biāo)題：線粒體基因組經(jīng)歷從頭DNA甲基化，保護(hù)mtDNA在圍植入期免受氧化損傷。
期刊：P NATL ACAD SCI USA（PNAS）
影響因子：IF 9.4 / Q1
結(jié)果圖形
（1）著床前期窗口期間mtDNA從頭甲基化與線粒體氧化應(yīng)激時(shí)空重疊。
使用甲基化DNA免疫沉淀測(cè)序（MeDIP-seq）分析小鼠E3.5囊胚、E7.5上胚層和E10.5胚胎的mtDNA甲基化模式，這些時(shí)間點(diǎn)代表核基因組DNA從頭甲基化的發(fā)育窗口。
圖1：著床前窗口期間mtDNA從頭甲基化與線粒體氧化應(yīng)激的時(shí)空重疊。
A. 比較E3.5和E7.5胚胎的總ATP（adenosine triphosphate）水平(左)、OXPHOS依賴性ATP產(chǎn)生（中）和相對(duì)貢獻(xiàn)（右）。
B. E3.5和E7.5胚胎的線粒體膜電位。右側(cè)通過定量紅色(JC-1聚集體)：綠色(JC-1單體)熒光比例來測(cè)量線粒體膜電位。
C. MitoSOX(一種特異性線粒體探針)檢測(cè)E3.5和E7.5胚胎內(nèi)線粒體ROS熒光圖像。右側(cè):定量檢測(cè)內(nèi)線粒體ROS水平。
D. MeDIP-seq檢測(cè)小鼠線粒體基因組在E3.5、E7.5和E10.5胚胎中的甲基化譜。y軸顯示每500bp MeDIP-reads的歸一化富集。在線性化mtDNA圖譜下方的注釋顯示mtDNA元件的位點(diǎn)。
E. 基于三個(gè)發(fā)育階段的MeDIP富集評(píng)分，對(duì)線粒體基因組的所有區(qū)間進(jìn)行熱圖分析。右側(cè)：E3.5時(shí)不同平均富集評(píng)分的三個(gè)子類的mtDNA甲基化動(dòng)態(tài)。
F. 具有相對(duì)高（≥2.6%，HCP）、中等（>1.2%且<2.6%，ICP）或低（≤1.2%，LCP）CpG密度的三個(gè)子類別區(qū)間的mtDNA甲基化動(dòng)態(tài)。
G. 在三個(gè)發(fā)育階段具有不同富集評(píng)分的富集區(qū)間比例。
H. 使用MeDIP-qPCR檢測(cè)著床前期連續(xù)發(fā)育階段選定區(qū)域的相對(duì)甲基化水平，包括重鏈和輕鏈蛋白編碼基因（Nd5, Nd6）、非編碼基因（12s）以及調(diào)控區(qū)域（D-loop）。數(shù)據(jù)表示三個(gè)重復(fù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。*P < 0.05，**P < 0.01。
(2) DNMT3A和DNMT3B在發(fā)育過程中進(jìn)入到線粒體中并催化mtDNA從頭甲基化。
圖2：DNMT3A和DNMT3B在發(fā)育過程中進(jìn)入到線粒體中并催化mtDNA從頭甲基化。
A-B. 在E3.5、E7.5和E10.5胚胎中，對(duì)TOM20標(biāo)記的線粒體（環(huán)狀橫截面）與DNMT3A（A）或DNMT3B（B）的互作進(jìn)行高質(zhì)量3D顯微重建超分辨率免疫熒光分析。
C. 利用金耦聯(lián)抗體通過免疫電子顯微鏡檢測(cè)E7.5胚胎中DNMT3A和DNMT3B的線粒體定位。
D.在E9.5和E10.5胚胎的純化線粒體中對(duì)DNMT3A和DNMT3B進(jìn)行Western Blot分析。
E-F. 在著床前期選定區(qū)域的DNMT3A-mtDNA（E）和DNMT3B-mtDNA（F）物理互作ChIP分析。 G. MeDIP-qPCR檢測(cè)野生型、Dnmt3a−/−和Dnmt3b−/− E10.5胚胎的選定區(qū)域相對(duì)甲基化水平。
（3）DNMT3A和DNMT3B含有促進(jìn)高效線粒體易位的功能性MTS
C-D. 在E3.5、E7.5和E10.5胚胎中，通過RT-PCR從成熟轉(zhuǎn)錄本中擴(kuò)增出能夠編碼DNMT3A（C）和DNMT3B（D）的MTS的瓊脂糖凝膠電泳。
E. 利用預(yù)測(cè)的DNMT3A和DNMT3B的MTS介導(dǎo)EGFP在線粒體中的轉(zhuǎn)移，這些EGFP被瞬時(shí)轉(zhuǎn)染到NIH/3T3細(xì)胞中。
（4）mtDNA從頭甲基化功能保護(hù)線粒體基因組免受氧化損傷。
圖4：mtDNA從頭甲基化保護(hù)線粒體基因組免受氧化損傷。
A-B. 在野生型、Dnmt3a−/−和Dnmt3b−/−著床后胚胎中，對(duì)長距離區(qū)域內(nèi)（A）和選定區(qū)域內(nèi)（B）的mtDNA損傷進(jìn)行定量檢測(cè)。
C. 線粒體靶向共表達(dá)Dnmt3a和Dnmt3b，以及單獨(dú)過表達(dá)Dnmt3a或Dnmt3b，對(duì)NIH/3T3細(xì)胞選定區(qū)域內(nèi)相對(duì)甲基化水平的影響。
D. 線粒體靶向共表達(dá)Dnmt3a和Dnmt3b，以及單獨(dú)過表達(dá)Dnmt3a或Dnmt3b，對(duì)保護(hù)NIH/3T3細(xì)胞中mtDNA免受H2O2誘導(dǎo)的氧化損傷的影響。
參考文獻(xiàn)：
Yue Y, Ren L, Zhang C, Miao K, Tan K, Yang Q, Hu Y, Xi G, Luo G, Yang M, Zhang J, Hou Z, An L, Tian J. Mitochondrial genome undergoes de novo DNA methylation that protects mtDNA against oxidative damage during the peri-implantation window. Proc Natl Acad Sci U S A. 2022 Jul 26;119(30):e2201168119. doi: 10.1073/pnas.2201168119. PubMed PMID: 35858425.
在早期哺乳動(dòng)物胚胎中，線粒體氧化代謝增強(qiáng)是著床后生存和發(fā)育的重要特征；著床前期的線粒體重塑是正常胚胎發(fā)生的關(guān)鍵事件。在這些變化中，氧化磷酸化（OXPHOS）增強(qiáng)對(duì)于支持著床后胚胎的高能量需求至關(guān)重要，但線粒體氧化代謝的增強(qiáng)，同時(shí)也導(dǎo)致線粒體內(nèi)大量ROS的積累，由此產(chǎn)生的線粒體氧化應(yīng)激會(huì)破壞早期胚胎線粒體DNA（mtDNA）穩(wěn)定性。在圍植入期，盡管多種抗氧化機(jī)制會(huì)被激活以清除細(xì)胞內(nèi)大量的ROS，但線粒體內(nèi)部是否存在對(duì)抗氧化應(yīng)激的自我保護(hù)機(jī)制，一直都不清楚。同時(shí)線粒體基因組在此過程中發(fā)生DNA甲基化，它與線粒體應(yīng)激增強(qiáng)的時(shí)空重合，那mtDNA甲基化是否在維持線粒體基因組穩(wěn)定性方面發(fā)揮作用呢？
近期，中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院動(dòng)物繁殖與發(fā)育科學(xué)系岳媛博士和任立坤博士為論文共同第一作者、田見暉教授和安磊教授為論文共同通訊在美國科學(xué)院院刊（PNAS）正式發(fā)表了題為“Mitochondrial genome undergoes de novo DNA methylation that protects mtDNA against oxidative damage during the peri-implantation window“的研究論文，研究揭示了早期胚胎通過線粒體DNA de novo甲基化（de novo mtDNA methylation）保護(hù)線粒體基因組穩(wěn)定性的全新機(jī)制。
標(biāo)題：線粒體基因組經(jīng)歷從頭DNA甲基化，保護(hù)mtDNA在圍植入期免受氧化損傷。
期刊：P NATL ACAD SCI USA（PNAS）
影響因子：IF 9.4 / Q1
本研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)線粒體基因組經(jīng)歷了mtDNA從頭甲基化，可以保護(hù)mtDNA免受著床前窗口期間氧化增強(qiáng)的損傷。線粒體基因組在在由囊胚向附植后胚胎發(fā)育的過程中，發(fā)生廣泛的mtDNA甲基化，從而在囊胚的低甲基化狀態(tài)中建立相對(duì)高甲基化的mtDNA。機(jī)制研究表明，DN甲基轉(zhuǎn)移酶3A（DNMT3A）和DNMT3B在這個(gè)過程中進(jìn)入線粒體并通過特異性線粒體定位序列（MTS）與mtDNA結(jié)合。功能喪失和獲得實(shí)驗(yàn)表明，DNMT3A和DNMT3B負(fù)責(zé)協(xié)同催化mtDNA從頭甲基化。最后，通過體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果證實(shí)了增加的mtDNA甲基化功能可以保護(hù)線粒體基因組免受線粒體氧化應(yīng)激增加誘導(dǎo)的mtDNA損傷，維持線粒體基因組穩(wěn)定性�？偟膩碚f，本研究結(jié)果揭示了關(guān)鍵圍發(fā)育期mtDNA甲基化動(dòng)態(tài)及其潛在機(jī)制，并揭示了線粒體表觀遺傳重塑與代謝變化之間的功能相關(guān)性，證明了核基因組-線粒體在建立線粒體表觀遺傳學(xué)和維持線粒體穩(wěn)態(tài)中的作用。
早期胚胎線粒體基因組保護(hù)機(jī)制模型
結(jié)果圖形
（1）著床前期窗口期間mtDNA從頭甲基化與線粒體氧化應(yīng)激時(shí)空重疊。
使用甲基化DNA免疫沉淀測(cè)序（MeDIP-seq）分析小鼠E3.5囊胚、E7.5上胚層和E10.5胚胎的mtDNA甲基化模式，這些時(shí)間點(diǎn)代表核基因組DNA從頭甲基化的發(fā)育窗口。
圖1：著床前窗口期間mtDNA從頭甲基化與線粒體氧化應(yīng)激的時(shí)空重疊。
B. E3.5和E7.5胚胎的線粒體膜電位。右側(cè)通過定量紅色(JC-1聚集體)：綠色(JC-1單體)熒光比例來測(cè)量線粒體膜電位。
C. MitoSOX(一種特異性線粒體探針)檢測(cè)E3.5和E7.5胚胎內(nèi)線粒體ROS熒光圖像。右側(cè):定量檢測(cè)內(nèi)線粒體ROS水平。
D. MeDIP-seq檢測(cè)小鼠線粒體基因組在E3.5、E7.5和E10.5胚胎中的甲基化譜。y軸顯示每500bp MeDIP-reads的歸一化富集。在線性化mtDNA圖譜下方的注釋顯示mtDNA元件的位點(diǎn)。
E. 基于三個(gè)發(fā)育階段的MeDIP富集評(píng)分，對(duì)線粒體基因組的所有區(qū)間進(jìn)行熱圖分析。右側(cè)：E3.5時(shí)不同平均富集評(píng)分的三個(gè)子類的mtDNA甲基化動(dòng)態(tài)。
F. 具有相對(duì)高（≥2.6%，HCP）、中等（>1.2%且<2.6%，ICP）或低（≤1.2%，LCP）CpG密度的三個(gè)子類別區(qū)間的mtDNA甲基化動(dòng)態(tài)。
G. 在三個(gè)發(fā)育階段具有不同富集評(píng)分的富集區(qū)間比例。
H. 使用MeDIP-qPCR檢測(cè)著床前期連續(xù)發(fā)育階段選定區(qū)域的相對(duì)甲基化水平，包括重鏈和輕鏈蛋白編碼基因（Nd5, Nd6）、非編碼基因（12s）以及調(diào)控區(qū)域（D-loop）。數(shù)據(jù)表示三個(gè)重復(fù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。*P < 0.05，**P < 0.01。
(2) DNMT3A和DNMT3B在發(fā)育過程中進(jìn)入到線粒體中并催化mtDNA從頭甲基化。
圖2：DNMT3A和DNMT3B在發(fā)育過程中進(jìn)入到線粒體中并催化mtDNA從頭甲基化。
C. 利用金耦聯(lián)抗體通過免疫電子顯微鏡檢測(cè)E7.5胚胎中DNMT3A和DNMT3B的線粒體定位。
D.在E9.5和E10.5胚胎的純化線粒體中對(duì)DNMT3A和DNMT3B進(jìn)行Western Blot分析。
E-F. 在著床前期選定區(qū)域的DNMT3A-mtDNA（E）和DNMT3B-mtDNA（F）物理互作ChIP分析。 G. MeDIP-qPCR檢測(cè)野生型、Dnmt3a−/−和Dnmt3b−/− E10.5胚胎的選定區(qū)域相對(duì)甲基化水平。
（3）DNMT3A和DNMT3B含有促進(jìn)高效線粒體易位的功能性MTS
圖3：DNMT3A和DNMT3B含有促進(jìn)高效線粒體轉(zhuǎn)移的功能性線粒體定位序列（MTS）。
A-B. DNMT3B（A）和DNMT3A（B）的MTS中代表性α-螺旋結(jié)構(gòu)（紅色）及其相應(yīng)殘基（紅色文字）的帶狀模型。C-D. 在E3.5、E7.5和E10.5胚胎中，通過RT-PCR從成熟轉(zhuǎn)錄本中擴(kuò)增出能夠編碼DNMT3A（C）和DNMT3B（D）的MTS的瓊脂糖凝膠電泳。
E. 利用預(yù)測(cè)的DNMT3A和DNMT3B的MTS介導(dǎo)EGFP在線粒體中的轉(zhuǎn)移，這些EGFP被瞬時(shí)轉(zhuǎn)染到NIH/3T3細(xì)胞中。
（4）mtDNA從頭甲基化功能保護(hù)線粒體基因組免受氧化損傷。
圖4：mtDNA從頭甲基化保護(hù)線粒體基因組免受氧化損傷。
C. 線粒體靶向共表達(dá)Dnmt3a和Dnmt3b，以及單獨(dú)過表達(dá)Dnmt3a或Dnmt3b，對(duì)NIH/3T3細(xì)胞選定區(qū)域內(nèi)相對(duì)甲基化水平的影響。
D. 線粒體靶向共表達(dá)Dnmt3a和Dnmt3b，以及單獨(dú)過表達(dá)Dnmt3a或Dnmt3b，對(duì)保護(hù)NIH/3T3細(xì)胞中mtDNA免受H2O2誘導(dǎo)的氧化損傷的影響。
參考文獻(xiàn)：
Yue Y, Ren L, Zhang C, Miao K, Tan K, Yang Q, Hu Y, Xi G, Luo G, Yang M, Zhang J, Hou Z, An L, Tian J. Mitochondrial genome undergoes de novo DNA methylation that protects mtDNA against oxidative damage during the peri-implantation window. Proc Natl Acad Sci U S A. 2022 Jul 26;119(30):e2201168119. doi: 10.1073/pnas.2201168119. PubMed PMID: 35858425.
標(biāo)簽：
DNA甲基化
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- 文獻(xiàn)解讀：DNA甲基化保護(hù)早期胚胎線粒體基因組穩(wěn)定性
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