細(xì)胞培養(yǎng)中的細(xì)菌污染專(zhuān)治方法詳解

細(xì)菌形態(tài)：

細(xì)菌可以呈現(xiàn)三種基本形狀之一：球形（球菌）、桿狀（芽孢桿菌）或彎曲（弧菌、螺菌）。例如，一些球菌會(huì)成對(duì)存在，大多數(shù)鏈球菌類(lèi)似于一長(zhǎng)串珠子，而葡萄球菌則形成隨機(jī)團(tuán)塊（“葡萄球菌”這個(gè)名字來(lái)源于希臘語(yǔ)staphyle，意思是“葡萄簇”）。此外，一些球菌以方形或立方體團(tuán)塊形式出現(xiàn)。桿菌通常單獨(dú)出現(xiàn)，但有些菌株會(huì)形成長(zhǎng)鏈，例如棒狀桿菌，經(jīng)常以任意角度相互連接。有些桿菌的末端是尖的，而另一些桿菌的末端是方形的。還有些桿狀桿彎曲成逗號(hào)形狀通常被稱(chēng)為弧菌，包括引起霍亂的霍亂弧菌。其他形狀的細(xì)菌包括彎曲的螺旋體，形成類(lèi)似于開(kāi)瓶器的螺旋體。
 

圖二 革蘭氏陽(yáng)性與陰性的比較（圖源網(wǎng)絡(luò)）

 

02細(xì)菌污染現(xiàn)象

細(xì)菌在適宜的條件下會(huì)快速增殖，因此細(xì)菌污染的進(jìn)程一般很快，有的在培養(yǎng)箱過(guò)夜便可觀察到培養(yǎng)液渾濁，同時(shí)因?yàn)榧?xì)菌的代謝產(chǎn)生酸性物質(zhì)使培養(yǎng)液的pH下降變黃。在顯微鏡下，會(huì)發(fā)現(xiàn)細(xì)沙狀/桿狀/球狀的黑點(diǎn)均勻密集分布，有的甚至?xí)�產(chǎn)生異樣的氣味。

下面讓我們通過(guò)一些圖片來(lái)進(jìn)一步具象化細(xì)菌污染吧！

圖三 左側(cè)為正常培養(yǎng)基顏色，右側(cè)為細(xì)菌污染后的培養(yǎng)基，可明顯發(fā)現(xiàn)變黃、渾濁。（圖源客戶(hù)）


圖四 細(xì)菌污染初期培養(yǎng)基粉紅色，略帶渾濁。（圖源客戶(hù)）


圖五 細(xì)菌污染可能造成細(xì)胞增殖緩慢或形態(tài)上的改變（多角、多核等），細(xì)胞質(zhì)中產(chǎn)生空泡、細(xì)胞不附著。（圖源客戶(hù)）


圖六 細(xì)菌污染嚴(yán)重時(shí)，顯微鏡下觀察呈細(xì)沙狀，放大倍數(shù)仔細(xì)觀察可以見(jiàn)黑點(diǎn)會(huì)存在均一的細(xì)菌形態(tài)如桿狀、球狀、彎曲等。（需要區(qū)別于血清沉淀，血清沉淀通常形態(tài)不一）

03 細(xì)菌污染的防治

細(xì)菌的克星：抗生素

又稱(chēng)為抗菌素，是指由微生物（包括細(xì)菌、真菌、放線菌屬）或高等動(dòng)植物在生活過(guò)程中所產(chǎn)生的具有抗病原體或其他活性的一類(lèi)次級(jí)代謝產(chǎn)物，能干擾其他生活細(xì)胞發(fā)育功能的化學(xué)物質(zhì)�？股�素等抗菌劑的抑菌或殺菌作用，主要是針對(duì)“細(xì)菌有而人（或其他動(dòng)植物）沒(méi)有”的機(jī)制進(jìn)行殺傷，包含四大作用機(jī)理，即：抑制細(xì)菌細(xì)胞壁合成，增強(qiáng)細(xì)菌細(xì)胞膜通透性，干擾細(xì)菌蛋白質(zhì)合成以及抑制細(xì)菌核酸復(fù)制轉(zhuǎn)錄。



抗生素的作用具有選擇性，不同抗生素對(duì)不同病原菌的作用不一樣。對(duì)某種抗生素敏感的病原菌種類(lèi)稱(chēng)為該抗生素的抗生譜（抗菌譜）。僅對(duì)單一菌種或?qū)儆锌咕�作用，這類(lèi)抗生素稱(chēng)為窄譜抗菌素，如青霉素的抗菌譜主要包括革蘭氏陽(yáng)性菌和某些陰性球菌，鏈霉素的抗菌譜主要是部分革蘭氏陰性桿菌。在細(xì)胞培養(yǎng)中，為了起到預(yù)防的作用我們常加入1%的青鏈雙抗（C3420-0100），抗生素聯(lián)合使用目的是減少細(xì)菌耐藥性，擴(kuò)大抗菌范圍。但是雙抗并不是營(yíng)養(yǎng)體系，有研究證實(shí)抗生素會(huì)影響某些細(xì)胞的增殖和細(xì)胞代謝等，因此在無(wú)菌條件良好的情況下，無(wú)需添加。

圖七 某些抗生素的抑菌原理^[1]

想“對(duì)癥用藥”需要菌種鑒定
可以提取細(xì)菌基因組DNA，通過(guò)PCR擴(kuò)增測(cè)序之后，與GeneBank或者Eztaxon對(duì)比即可。一般序列相似度在99%以上就可以認(rèn)為是同一個(gè)種細(xì)菌（當(dāng)然也有例外，DNA序列僅僅是一個(gè)參考指標(biāo)）。常規(guī)鑒定內(nèi)容有形態(tài)特征和理化特性。形態(tài)特征包括顯微形態(tài)和培養(yǎng)特征；理化特性包括營(yíng)養(yǎng)類(lèi)型、碳氮源利用能力、各種代謝反應(yīng)、酶反應(yīng)和血清學(xué)反應(yīng)等。


在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中除了添加抗生素我們應(yīng)該做好以下工作

污染后處理：

●及時(shí)丟棄發(fā)生污染的細(xì)胞

●對(duì)環(huán)境進(jìn)行消殺，紫外線滅菌、消毒液擦拭培養(yǎng)箱、工作臺(tái)等

●檢查所有用過(guò)的相關(guān)試劑是否發(fā)生污染，條件允許的情況下可以開(kāi)封新試劑使用

對(duì)于重要且污染相對(duì)較輕的細(xì)胞：可以考慮先用含有5%-10%的雙抗的PBS進(jìn)行多次清洗，再用含5%-10%的抗生素的培養(yǎng)基用藥 24h-48h小時(shí)，換液使用含有2-3%的抗生素培養(yǎng)基培養(yǎng)24h，最后再換回常規(guī)的含1%雙抗的培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，期間要隨時(shí)觀察細(xì)胞的狀態(tài)。但需要注意的是：一旦發(fā)生污染后再使用抗生素常常難以根除，另有研究表明，高濃度抗生素可能對(duì)細(xì)胞有負(fù)面影響。

預(yù)防大于處理：

在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，我們不希望看到任何微生物污染的情況發(fā)生。為了避免浪費(fèi)有限的精力和資源，應(yīng)優(yōu)先預(yù)防污染的發(fā)生。因此我們?cè)诩?xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中需要遵循無(wú)菌技術(shù)的所有準(zhǔn)則，包括無(wú)菌工作區(qū)、無(wú)菌試劑、良好的個(gè)人衛(wèi)生和無(wú)菌處理等。當(dāng)然，最最最重要的是我們要擁有足夠且正確的知識(shí)和意識(shí)，才能夠輕松應(yīng)對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中發(fā)生的種種情形。

參考文獻(xiàn)：
[1] Kapoor G, Saigal S, Elongavan A. Action and resistance mechanisms of antibiotics: A guide for clinicians. J Anaesthesiol Clin Pharmacol. 2017 Jul-Sep;33(3):300-305.
[2] Kadner, Robert J. Rogers, Kara. "bacteria". Encyclopedia Britannica, 15 Aug. 2024.