PI3KCIIα自噬防小鼠低剪切應力引起的內(nèi)皮功能障礙與動脈粥樣硬化
PI3KCIIα-Dependent Autophagy Program Protect From Endothelial Dysfunction and Atherosclerosis in Response to Low Shear Stress in Mice
Keywords: atherosclerosis; autophagy; endothelial cell; phosphoinositide 3-kinase; primary cilium; shear stress.
動脈粥樣硬化是一種累及大動脈和中動脈的復雜、多因素性病變，在心血管疾病中占有很大比例。衰老或代謝紊亂在動脈粥樣硬化斑塊沉積的第一步中損害內(nèi)皮屏障完整性的主要誘發(fā)因素。除了全身因素外，內(nèi)皮細胞（EC）單層還不斷暴露于血流和相關的流體剪切應力中。剪切應力強烈影響EC穩(wěn)態(tài)，不同的剪切應力模式?jīng)Q定了動脈粥樣硬化病變沿血管樹的不均勻分布。
自噬是一種由各種細胞應激誘導的分解代謝過程，它被激活以確保細胞質成分被自噬體隔離并輸送到溶酶體進行降解和回收。自噬體的生物發(fā)生由 ULK1/PIK3C3 復合物I（VPS34-VPS15-Beclin1-ATG14L）啟動，其中VPS34是 Ⅲ型磷脂酰肌醇激酶（PI3K-Ⅲ），其催化底物磷脂酰肌醇（PI）磷酸化生成的3-磷酸磷脂酰肌醇（PI3P）為自噬小體形成所必需的。研究表明，自噬程序被激活以響應高流體剪切應力（HSS），誘導內(nèi)皮保護并預防動脈粥樣硬化的發(fā)展。相比之下，低流體剪切應力（LSS）在內(nèi)皮細胞中觸發(fā)的自噬反應不太明顯。然而，尚不清楚LSS和HSS是否在不同的激活水平上驅動相同的信號通路，或者使用不同的信號模塊來控制EC功能。
鑒于此，法國INSERM-圖盧茲大學代謝與心血管疾病研究所及意大利都靈分子生物技術中心等的研究團隊曾探討了小鼠體內(nèi)不同動脈剪切應力區(qū)域以及體外流動室中EC的自噬過程，發(fā)現(xiàn)動脈內(nèi)皮LSS和HSS涉及不同的自噬信號轉導模塊，需要不同類別的PI3K。研究工作揭示了 II 類 PI3Kα 在控制自噬中的重要作用，并證明這種機制是由PI3KCIIα-（磷酸肌醇 3-激酶II 類α）依賴性初級纖毛組裝調(diào)控驅動的。具體研究成果發(fā)表在 Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology 期刊題為“PI3KCIIα-Dependent Autophagy Program Protect From Endothelial Dysfunction and Atherosclerosis in Response to Low Shear Stress in Mice”。
首先，為了探索LSS驅動內(nèi)皮自噬過程的潛在機制，研究了VPS34和PI3KCIIα表達水平在ECs對LSS的響應。與靜態(tài)培養(yǎng)的ECs相比，LSS（1 dyne/cm²）持續(xù)24 h的ECs中PI3KCIIα蛋白水平顯著升高（圖1 A），VPS34表達水平保持不變（圖1 B），表明PI3KCIIα優(yōu)先參與ECs對LSS的響應。
為了研究這些PI3Ks在LSS和HSS誘導的自噬中的潛在作用，使用小干擾RNA敲低PI3KCIIα和VPS34（圖1 C、J），與陰性對照細胞相比，PI3KCIIα敲低后，LSS誘導的LC3B陽性結構急劇降低，而VPS34敲低則沒有影響（圖1 C）。這些結果在毛細管和蛋白質印跡實驗中得到證實（圖1 D）。相比之下，HSS（18 dynes/cm2）對ECs中LC3-B表達的分析表明，敲低VPS34導致自噬減少，而敲低PI3KCIIα則沒有影響（圖1 G、H）。
這些結果證明了PI3KCIIα而非VPS34在內(nèi)皮LSS-相關自噬機制動員中的重要性，并強調(diào)了內(nèi)皮中不同機械力誘導的分子機制的特異性。
為了進一步研究PI3KCIIα在體內(nèi)動脈疾病背景下EC生物學中的自噬功能，建立了載脂蛋白E基因缺失（ApoE−/−）小鼠和PI3KCIIα雜合缺失（PI3KCIIα+/−）小鼠，發(fā)現(xiàn)與 ApoE−/− 小鼠動脈的 LSS 區(qū)域相比，ApoE−/−PI3KCIIα+/− 小鼠內(nèi)皮LC3B標志物強度顯著降低，而HSS區(qū)內(nèi)皮中LC3B表達無變化，表明PI3KCIIα表達降低會損害體內(nèi)動脈內(nèi)皮LSS區(qū)域的自噬。
接下來，研究了PI3KCIIα依賴性自噬去除對EC功能的影響。通過分析PI3KCIIα雜合缺失對主動脈LSS和HSS區(qū)域EC形態(tài)的影響（圖2 A），發(fā)現(xiàn)ApoE−/−PI3KCIIα+/− 小鼠主動脈弓EC的大小明顯增加（圖2 B、C）。PI3KCIIα表達降低的小鼠中EC面積的增加與兩種基因型中相同內(nèi)皮區(qū)域主動脈弓細胞數(shù)量的減少相關（圖2 D）。相比之下，在兩種基因型的小鼠的降主動脈中均未發(fā)現(xiàn)EC大小或EC數(shù)的變化（圖2 E-G），表明PI3KCIIα表達降低特異性影響了動脈LSS區(qū)域的EC形態(tài)。
由于 EC 的主要功能是維持屏障完整性，因此研究了這種形態(tài)變化是否伴隨著 LDL（低密度脂蛋白）跨內(nèi)皮通量的變化。結果表明，PI3KCIIα的缺失導致體外ECs中穿胞作用顯著增加（圖2 H），表明PI3KCIIα是防止膽固醇在內(nèi)皮下空間沉積所必需的。此外，還觀察到PI3KCIIα敲低HUAEC 中DNA 損傷標記物磷酸化-H2AX 和衰老標志物p16 表達顯著增加（圖2 I、J），而ApoE−/− 與ApoE−/−PI3KCIIα+/− 小鼠EC中促炎細胞因子和炎性粘附分子的表達水平?jīng)]有改變。這些數(shù)據(jù)表明，PI3KCIIα 是內(nèi)皮穩(wěn)態(tài)的重要調(diào)節(jié)因子，特別是通過自噬在LSS區(qū)域。
此外，還評估了自噬存在內(nèi)在缺陷的 ApoE−/−PI3KCIIα+/− 小鼠中的動脈粥樣硬化斑塊負荷（圖2 K），觀察到小鼠LSS 區(qū)域的動脈粥樣硬化斑塊沉積顯著增加，但在 HSS 區(qū)域則沒有（圖2 L-N），血漿膽固醇水平也沒有變化（圖2 O）。這些數(shù)據(jù)表明，LSS特異性區(qū)域自噬的喪失導致動脈粥樣硬化增加。
雷帕霉素復合物1（mTORC1）通路是多種細胞類型中細胞大小和自噬的中心調(diào)節(jié)因子，并且是不同病理學中眾所周知的藥物靶點。為了進一步研究上述發(fā)現(xiàn)的分子和藥理學意義，假設 mTORC1 通路可以將 PI3KCIIα 與內(nèi)皮細胞的自噬聯(lián)系起來。為了驗證這一假設，在體外 LSS 下評估其效應子p70-S6 激酶在存在或不存在 PI3KCIIα 下的磷酸化水平來測量 mTORC1 激活水平，觀察到PI3KCIIα的缺失導致磷酸化-p70-S6激酶水平顯著升高，表明mTOR受PI3KCIIα負調(diào)控（圖3 A）。
為了證實這種機制在體內(nèi)的重要性，評估了 mTOR 的藥理學抑制是否可以恢復因 PI3KCIIα 表達降低而改變的內(nèi)皮功能。將ApoE−/−PI3KCIIα+/− 小鼠給予依維莫司（mTOR抑制劑）處理（圖3 B），發(fā)現(xiàn)依維莫司導致在 LSS 區(qū)域自噬顯著增加（圖3 C、D），并恢復EC大小（圖3 G、H），而對HSS區(qū)域這兩個參數(shù)沒有任何影響（圖3 E、F、I、J），這表明 PI3KCIIα 在控制動脈 LSS 區(qū)域的 mTOR 信號傳導中的重要性。此外，實驗證明了依維莫司處理在ApoE−/−PI3KCIIα+/− 小鼠中顯著減少動脈粥樣硬化沉積，表明mTORC1 調(diào)控將 PI3KCIIα 與自噬聯(lián)系起來以響應 LSS，抑制mTORC1可以抵消這種病理背景下PI3KCIIα的缺失。
最后，為了進一步研究 PI3KCIIα 和 mTOR 調(diào)控之間的聯(lián)系，研究人員探討了初級纖毛的影響。初級纖毛是一種重要的機械傳感器，一些研究描述了PI3KCIIα是調(diào)控初級纖毛生物合成的關鍵酶，并證明 mTOR 信號可由初級纖毛激活。實驗觀察到動脈LSS區(qū)域的ECs上初級纖毛的富集。與ApoE−/− 小鼠動脈的LSS區(qū)域相比，ApoE−/−PI3KCIIα+/− 小鼠中的初級纖毛數(shù)量總體減少，纖毛縮短。這些結果表明，PI3CIIα控制內(nèi)皮初級纖毛的生物發(fā)生以響應LSS。
然后敲低纖毛發(fā)生關鍵基因IFT88以研究在PI3KCIIα缺失的情況下是否會導致體內(nèi)穩(wěn)態(tài)缺陷（圖4 A、B）。在IFT88缺失的EC中，初級纖毛減少（圖4 C），缺乏LC3B陽性結構（圖4 D），LC3-B表達降低（圖4 E），EC增大（圖4 F、G）。這些結果與在沒有PI3KCIIα的情況下觀察到的結果相似，表明PI3KCIIα的缺失模擬了原發(fā)性纖毛缺陷表型，表明該激酶可能通過初級纖毛調(diào)控LSS誘導的自噬和EC穩(wěn)態(tài)。
總的來說，該研究結果表明，動脈系統(tǒng)內(nèi)的機械應力變異性決定了EC的自噬反應，對動脈粥樣硬化有直接影響。這項工作揭示了PI3KCIIα/mTOR是LSS區(qū)域內(nèi)皮機械傳感的關鍵調(diào)節(jié)因子，并闡明了內(nèi)皮初級纖毛在動脈粥樣硬化病因中的重要作用。
參考文獻：Nasr M, Fay A, Lupieri A, Malet N, Darmon A, Zahreddine R, Swiader A, Wahart A, Viaud J, Nègre-Salvayre A, Hirsch E, Monteyne D, Perez-Morgà D, Dupont N, Codogno P, Ramel D, Morel E, Laffargue M, Gayral S. PI3KCIIα-Dependent Autophagy Program Protects From Endothelial Dysfunction and Atherosclerosis in Response to Low Shear Stress in Mice. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2024 Mar;44(3):620-634. doi: 10.1161/ATVBAHA.123.319978. Epub 2023 Dec 28. PMID: 38152888.
原文鏈接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38152888/
IF：8.7
期刊ISSN 1079-5642
E-ISSN 1524-4636
圖片來源：所有圖片均來源于參考文獻
小編旨在分享、學習、交流生物科學等領域的研究進展。如有侵權或引文不當請聯(lián)系小編修正。如有任何的想法以及建議，歡迎聯(lián)系小編。感謝各位的瀏覽以及關注！進入官網(wǎng)www.naturethink.com或關注“Naturethink”公眾號，了解更多相關內(nèi)容。
點擊了解：流體剪切力系統(tǒng)
Keywords: atherosclerosis; autophagy; endothelial cell; phosphoinositide 3-kinase; primary cilium; shear stress.
動脈粥樣硬化是一種累及大動脈和中動脈的復雜、多因素性病變，在心血管疾病中占有很大比例。衰老或代謝紊亂在動脈粥樣硬化斑塊沉積的第一步中損害內(nèi)皮屏障完整性的主要誘發(fā)因素。除了全身因素外，內(nèi)皮細胞（EC）單層還不斷暴露于血流和相關的流體剪切應力中。剪切應力強烈影響EC穩(wěn)態(tài)，不同的剪切應力模式?jīng)Q定了動脈粥樣硬化病變沿血管樹的不均勻分布。
自噬是一種由各種細胞應激誘導的分解代謝過程，它被激活以確保細胞質成分被自噬體隔離并輸送到溶酶體進行降解和回收。自噬體的生物發(fā)生由 ULK1/PIK3C3 復合物I（VPS34-VPS15-Beclin1-ATG14L）啟動，其中VPS34是 Ⅲ型磷脂酰肌醇激酶（PI3K-Ⅲ），其催化底物磷脂酰肌醇（PI）磷酸化生成的3-磷酸磷脂酰肌醇（PI3P）為自噬小體形成所必需的。研究表明，自噬程序被激活以響應高流體剪切應力（HSS），誘導內(nèi)皮保護并預防動脈粥樣硬化的發(fā)展。相比之下，低流體剪切應力（LSS）在內(nèi)皮細胞中觸發(fā)的自噬反應不太明顯。然而，尚不清楚LSS和HSS是否在不同的激活水平上驅動相同的信號通路，或者使用不同的信號模塊來控制EC功能。
鑒于此，法國INSERM-圖盧茲大學代謝與心血管疾病研究所及意大利都靈分子生物技術中心等的研究團隊曾探討了小鼠體內(nèi)不同動脈剪切應力區(qū)域以及體外流動室中EC的自噬過程，發(fā)現(xiàn)動脈內(nèi)皮LSS和HSS涉及不同的自噬信號轉導模塊，需要不同類別的PI3K。研究工作揭示了 II 類 PI3Kα 在控制自噬中的重要作用，并證明這種機制是由PI3KCIIα-（磷酸肌醇 3-激酶II 類α）依賴性初級纖毛組裝調(diào)控驅動的。具體研究成果發(fā)表在 Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology 期刊題為“PI3KCIIα-Dependent Autophagy Program Protect From Endothelial Dysfunction and Atherosclerosis in Response to Low Shear Stress in Mice”。
首先，為了探索LSS驅動內(nèi)皮自噬過程的潛在機制，研究了VPS34和PI3KCIIα表達水平在ECs對LSS的響應。與靜態(tài)培養(yǎng)的ECs相比，LSS（1 dyne/cm²）持續(xù)24 h的ECs中PI3KCIIα蛋白水平顯著升高（圖1 A），VPS34表達水平保持不變（圖1 B），表明PI3KCIIα優(yōu)先參與ECs對LSS的響應。
為了研究這些PI3Ks在LSS和HSS誘導的自噬中的潛在作用，使用小干擾RNA敲低PI3KCIIα和VPS34（圖1 C、J），與陰性對照細胞相比，PI3KCIIα敲低后，LSS誘導的LC3B陽性結構急劇降低，而VPS34敲低則沒有影響（圖1 C）。這些結果在毛細管和蛋白質印跡實驗中得到證實（圖1 D）。相比之下，HSS（18 dynes/cm2）對ECs中LC3-B表達的分析表明，敲低VPS34導致自噬減少，而敲低PI3KCIIα則沒有影響（圖1 G、H）。
這些結果證明了PI3KCIIα而非VPS34在內(nèi)皮LSS-相關自噬機制動員中的重要性，并強調(diào)了內(nèi)皮中不同機械力誘導的分子機制的特異性。
圖1 不同的PI3K（磷酸肌苷3-激酶）信號模塊控制自噬響應剪切應力。
為了進一步研究PI3KCIIα在體內(nèi)動脈疾病背景下EC生物學中的自噬功能，建立了載脂蛋白E基因缺失（ApoE−/−）小鼠和PI3KCIIα雜合缺失（PI3KCIIα+/−）小鼠，發(fā)現(xiàn)與 ApoE−/− 小鼠動脈的 LSS 區(qū)域相比，ApoE−/−PI3KCIIα+/− 小鼠內(nèi)皮LC3B標志物強度顯著降低，而HSS區(qū)內(nèi)皮中LC3B表達無變化，表明PI3KCIIα表達降低會損害體內(nèi)動脈內(nèi)皮LSS區(qū)域的自噬。
接下來，研究了PI3KCIIα依賴性自噬去除對EC功能的影響。通過分析PI3KCIIα雜合缺失對主動脈LSS和HSS區(qū)域EC形態(tài)的影響（圖2 A），發(fā)現(xiàn)ApoE−/−PI3KCIIα+/− 小鼠主動脈弓EC的大小明顯增加（圖2 B、C）。PI3KCIIα表達降低的小鼠中EC面積的增加與兩種基因型中相同內(nèi)皮區(qū)域主動脈弓細胞數(shù)量的減少相關（圖2 D）。相比之下，在兩種基因型的小鼠的降主動脈中均未發(fā)現(xiàn)EC大小或EC數(shù)的變化（圖2 E-G），表明PI3KCIIα表達降低特異性影響了動脈LSS區(qū)域的EC形態(tài)。
由于 EC 的主要功能是維持屏障完整性，因此研究了這種形態(tài)變化是否伴隨著 LDL（低密度脂蛋白）跨內(nèi)皮通量的變化。結果表明，PI3KCIIα的缺失導致體外ECs中穿胞作用顯著增加（圖2 H），表明PI3KCIIα是防止膽固醇在內(nèi)皮下空間沉積所必需的。此外，還觀察到PI3KCIIα敲低HUAEC 中DNA 損傷標記物磷酸化-H2AX 和衰老標志物p16 表達顯著增加（圖2 I、J），而ApoE−/− 與ApoE−/−PI3KCIIα+/− 小鼠EC中促炎細胞因子和炎性粘附分子的表達水平?jīng)]有改變。這些數(shù)據(jù)表明，PI3KCIIα 是內(nèi)皮穩(wěn)態(tài)的重要調(diào)節(jié)因子，特別是通過自噬在LSS區(qū)域。
此外，還評估了自噬存在內(nèi)在缺陷的 ApoE−/−PI3KCIIα+/− 小鼠中的動脈粥樣硬化斑塊負荷（圖2 K），觀察到小鼠LSS 區(qū)域的動脈粥樣硬化斑塊沉積顯著增加，但在 HSS 區(qū)域則沒有（圖2 L-N），血漿膽固醇水平也沒有變化（圖2 O）。這些數(shù)據(jù)表明，LSS特異性區(qū)域自噬的喪失導致動脈粥樣硬化增加。
圖2 PI3KCIIα的雜合缺失會損害內(nèi)皮細胞低剪切應力（LSS）區(qū)域的穩(wěn)態(tài)，增加動脈粥樣硬化。
雷帕霉素復合物1（mTORC1）通路是多種細胞類型中細胞大小和自噬的中心調(diào)節(jié)因子，并且是不同病理學中眾所周知的藥物靶點。為了進一步研究上述發(fā)現(xiàn)的分子和藥理學意義，假設 mTORC1 通路可以將 PI3KCIIα 與內(nèi)皮細胞的自噬聯(lián)系起來。為了驗證這一假設，在體外 LSS 下評估其效應子p70-S6 激酶在存在或不存在 PI3KCIIα 下的磷酸化水平來測量 mTORC1 激活水平，觀察到PI3KCIIα的缺失導致磷酸化-p70-S6激酶水平顯著升高，表明mTOR受PI3KCIIα負調(diào)控（圖3 A）。
為了證實這種機制在體內(nèi)的重要性，評估了 mTOR 的藥理學抑制是否可以恢復因 PI3KCIIα 表達降低而改變的內(nèi)皮功能。將ApoE−/−PI3KCIIα+/− 小鼠給予依維莫司（mTOR抑制劑）處理（圖3 B），發(fā)現(xiàn)依維莫司導致在 LSS 區(qū)域自噬顯著增加（圖3 C、D），并恢復EC大小（圖3 G、H），而對HSS區(qū)域這兩個參數(shù)沒有任何影響（圖3 E、F、I、J），這表明 PI3KCIIα 在控制動脈 LSS 區(qū)域的 mTOR 信號傳導中的重要性。此外，實驗證明了依維莫司處理在ApoE−/−PI3KCIIα+/− 小鼠中顯著減少動脈粥樣硬化沉積，表明mTORC1 調(diào)控將 PI3KCIIα 與自噬聯(lián)系起來以響應 LSS，抑制mTORC1可以抵消這種病理背景下PI3KCIIα的缺失。
圖3 依維莫司治療可恢復小鼠內(nèi)皮細胞自噬，降低PI3KCIIα表達。
最后，為了進一步研究 PI3KCIIα 和 mTOR 調(diào)控之間的聯(lián)系，研究人員探討了初級纖毛的影響。初級纖毛是一種重要的機械傳感器，一些研究描述了PI3KCIIα是調(diào)控初級纖毛生物合成的關鍵酶，并證明 mTOR 信號可由初級纖毛激活。實驗觀察到動脈LSS區(qū)域的ECs上初級纖毛的富集。與ApoE−/− 小鼠動脈的LSS區(qū)域相比，ApoE−/−PI3KCIIα+/− 小鼠中的初級纖毛數(shù)量總體減少，纖毛縮短。這些結果表明，PI3CIIα控制內(nèi)皮初級纖毛的生物發(fā)生以響應LSS。
然后敲低纖毛發(fā)生關鍵基因IFT88以研究在PI3KCIIα缺失的情況下是否會導致體內(nèi)穩(wěn)態(tài)缺陷（圖4 A、B）。在IFT88缺失的EC中，初級纖毛減少（圖4 C），缺乏LC3B陽性結構（圖4 D），LC3-B表達降低（圖4 E），EC增大（圖4 F、G）。這些結果與在沒有PI3KCIIα的情況下觀察到的結果相似，表明PI3KCIIα的缺失模擬了原發(fā)性纖毛缺陷表型，表明該激酶可能通過初級纖毛調(diào)控LSS誘導的自噬和EC穩(wěn)態(tài)。
圖4 PI3KCIIα 缺乏模擬內(nèi)皮細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)的原發(fā)性纖毛缺失。
圖5 圖形概要
總的來說，該研究結果表明，動脈系統(tǒng)內(nèi)的機械應力變異性決定了EC的自噬反應，對動脈粥樣硬化有直接影響。這項工作揭示了PI3KCIIα/mTOR是LSS區(qū)域內(nèi)皮機械傳感的關鍵調(diào)節(jié)因子，并闡明了內(nèi)皮初級纖毛在動脈粥樣硬化病因中的重要作用。
參考文獻：Nasr M, Fay A, Lupieri A, Malet N, Darmon A, Zahreddine R, Swiader A, Wahart A, Viaud J, Nègre-Salvayre A, Hirsch E, Monteyne D, Perez-Morgà D, Dupont N, Codogno P, Ramel D, Morel E, Laffargue M, Gayral S. PI3KCIIα-Dependent Autophagy Program Protects From Endothelial Dysfunction and Atherosclerosis in Response to Low Shear Stress in Mice. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2024 Mar;44(3):620-634. doi: 10.1161/ATVBAHA.123.319978. Epub 2023 Dec 28. PMID: 38152888.
原文鏈接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38152888/
IF：8.7
期刊ISSN 1079-5642
E-ISSN 1524-4636
圖片來源：所有圖片均來源于參考文獻
小編旨在分享、學習、交流生物科學等領域的研究進展。如有侵權或引文不當請聯(lián)系小編修正。如有任何的想法以及建議，歡迎聯(lián)系小編。感謝各位的瀏覽以及關注！進入官網(wǎng)www.naturethink.com或關注“Naturethink”公眾號，了解更多相關內(nèi)容。
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