ACE等揭示產(chǎn)前不良環(huán)境暴露通過DNA羥甲基化變化介導(dǎo)子代自閉癥
自閉癥譜系障礙（Autism spectrum disorder，ASD）是一種神經(jīng)發(fā)育障礙，以社交溝通障礙和刻板行為為主要特征。許多研究證明，妊娠期暴露于環(huán)境毒素會(huì)導(dǎo)致兒童中ASD患病率快速增長。1-硝基芘（1-Nitropyrene，1-NP）一種主要存在于柴油排放顆粒（DEPs）和烹飪排放中的特征性硝基多環(huán)芳烴（nitro-PAH）。早期報(bào)告顯示，妊娠晚期暴露于1-NP（10 µg/kg）與子代青少年學(xué)習(xí)力和記憶力下降有關(guān)。整個(gè)妊娠期暴露于1-NP（10、100 µg/kg）引起了子代成年階段的焦慮樣行為。盡管這些神經(jīng)系統(tǒng)疾病與1-NP暴露有關(guān)，但目前尚不清楚母親1-NP暴露是否在子代中誘導(dǎo)自閉癥樣行為。
越來越多證據(jù)表明內(nèi)側(cè)前額葉皮層（medial prefrontal cortex，mPFC）中的中間神經(jīng)元在社交溝通調(diào)節(jié)中發(fā)揮關(guān)鍵作用，中間神經(jīng)元遷移遲緩導(dǎo)致小鼠出現(xiàn)自閉癥樣行為。一些研究表明，羥甲基化修飾參與胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞和神經(jīng)干細(xì)胞遷移。那么產(chǎn)前1-NP暴露是否會(huì)通過抑制與中間神經(jīng)元遷移相關(guān)基因的羥甲基化修飾來抑制中間神經(jīng)元遷移呢？
2024年5月16日，安徽醫(yī)科大學(xué)碩士研究生趙婷為第一作者、合肥工業(yè)大學(xué)黃程青博士和安徽醫(yī)科大學(xué)張醫(yī)浩副教授為共同第一作者，安徽醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院徐德祥教授為通訊作者、王博副教授為共同通訊在《Advanced Science》（Adv Sci）期刊發(fā)表題為“Prenatal 1-Nitropyrene Exposure Causes Autism-Like Behavior Partially by Altering DNA Hydroxymethylation in Developing Brain”的研究論文，研究通過APOBEC-coupled epigenetic sequencing（ACE-seq）和RNA-seq多組學(xué)分析揭示了母體孕期1-NP暴露會(huì)通過改變發(fā)育大腦中與中間神經(jīng)元遷移相關(guān)的DNA羥甲基化調(diào)控下游基因表達(dá)，進(jìn)而介導(dǎo)子代出現(xiàn)自閉癥樣行為表型。此外，研究還表明補(bǔ)充α-酮戊二酸（α-KG，TET酶的輔因子），可以逆轉(zhuǎn)1-NP誘導(dǎo)的中間神經(jīng)元遷移相關(guān)基因特定位點(diǎn)的低羥甲基化，緩解中間神經(jīng)元遷移延遲并改善由1-NP引起的自閉癥。
標(biāo)題：Prenatal 1-Nitropyrene Exposure Causes Autism-Like Behavior Partially by Altering DNA Hydroxymethylation in Developing Brain（產(chǎn)前1-硝基芘暴露通過腦發(fā)育過程中DNA羥甲基化變化誘導(dǎo)子代自閉癥樣行為）
期刊：Advanced Science
影響因子：IF 14.3 / Q1
技術(shù)平臺(tái)：ACE-seq（易基因優(yōu)勢技術(shù)）、RNA-seq、行為評估、細(xì)胞功能分析等
研究摘要：
本研究旨在研究產(chǎn)前暴露于1-硝基芘（1-NP）對小鼠模型中自閉癥樣行為的影響。三室社交互動(dòng)測試結(jié)果表明，產(chǎn)前1-NP暴露在斷奶期間引起自閉癥樣行為。膜片鉗技術(shù)顯示，在1-NP暴露的斷奶幼崽內(nèi)側(cè)前額葉皮層中的抑制性突觸傳遞減少。免疫熒光顯示，產(chǎn)前1-NP暴露減少了胎兒和斷奶幼崽前額葉中谷氨酸脫羧酶67（GAD67）陽性的中間神經(jīng)元數(shù)量。此外，產(chǎn)前1-NP暴露導(dǎo)致GAD67陽性中間神經(jīng)元遷移延遲，并下調(diào)胎兒前腦與中間神經(jīng)元遷移相關(guān)的基因，如Nrg1、Erbb4和Sema3F。從機(jī)制上講，產(chǎn)前1-NP暴露通過抑制胎兒前腦中的TET活性，以誘導(dǎo)中間神經(jīng)元遷移相關(guān)基因的羥甲基化降低。補(bǔ)充α-KG（TET酶輔因子）可以逆轉(zhuǎn)1-NP誘導(dǎo)的中間神經(jīng)元遷移相關(guān)基因特定位點(diǎn)的低羥甲基化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，α-KG補(bǔ)充劑緩解了胎兒前腦中1-NP誘導(dǎo)的中間神經(jīng)元遷移延遲；母體α-KG補(bǔ)充劑改善了斷奶子代中1-NP誘導(dǎo)的自閉癥樣行為�？傊�，產(chǎn)前1-NP暴露可以通過發(fā)育中大腦中間神經(jīng)元遷移相關(guān)基因的DNA羥甲基化變化，而引起自閉癥樣行為。
實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：
30只懷孕小鼠隨機(jī)分為3組，分別給予不同劑量的1-NP（0、10、100μg/kg）；后續(xù)實(shí)驗(yàn)懷孕小鼠分為不同的處理組：對照組、1-NP暴露組、α-KG補(bǔ)充組以及1-NP+α-KG聯(lián)合組。產(chǎn)前在指定時(shí)間點(diǎn)收集胎兒前腦樣本；產(chǎn)后在指定時(shí)間點(diǎn)收集子代前額葉皮質(zhì)(mPFC)樣本。用于后續(xù)的行為評估、DNA羥甲基化檢測（ACE-seq）、TET酶活性檢測、α-KG水平檢測、RNA測序（RNA-seq）與RT-PCR驗(yàn)證、細(xì)胞功能分析等實(shí)驗(yàn)。
圖1：動(dòng)物和處理的實(shí)驗(yàn)方案
結(jié)果圖形：
（1）母體 1-NP 暴露對子代自閉癥樣行為的影響
A–F) 使用三室社交互動(dòng)測試來評估斷奶子代（PND28）的自閉癥樣行為。
G–L) 使用三室社交互動(dòng)測試來評估成年子代（PND70）的自閉癥樣行為。
（2）母體1-NP暴露對子代mPFC中微小抑制性后神經(jīng)突觸電流（miniature inhibitory postsynaptic current，mIPSC）的影響
圖3：母體1-NP暴露對子代mIPSC的影響。
A–F) 對斷奶子代（PND28）的興奮性神經(jīng)元進(jìn)行膜片鉗實(shí)驗(yàn)，以檢測前額葉皮層（mPFC）中的微小抑制性突觸后電流（mIPSC）。
G–L) 對成年子代（PND70）的興奮性神經(jīng)元進(jìn)行膜片鉗實(shí)驗(yàn)，以測量mPFC中的mIPSC。每組樣本量（N）為3只小鼠的12個(gè)興奮性神經(jīng)元。
（3）孕期母體1-NP暴露對斷奶子代mPFC中GAD67+中間神經(jīng)元的影響
圖4：母體1-NP暴露對斷奶子代GAD67中間神經(jīng)元的影響。
A–G) 雄性子代在PND28被安樂死，并且采集其前額葉皮層（mPFC）。
A-B. Western blot檢測GAD67。
C-D. Western blot檢測NeuN。
E. 免疫熒光（IF）分析mPFC各個(gè)亞區(qū)的GAD67+和NeuN+神經(jīng)元。
F. mPFC各個(gè)亞區(qū)中GAD67+與NeuN+神經(jīng)元的比例。
G. mPFC各個(gè)亞區(qū)中NeuN+神經(jīng)元的百分比。
H–N) 雌性子代在PND28被安樂死，并且收集其mPFC。
H-I. Western blot檢測GAD67。
J-K. Western blot檢測NeuN。
L. 免疫熒光分析mPFC各個(gè)亞區(qū)的GAD67+和NeuN+神經(jīng)元。
M. mPFC各個(gè)亞區(qū)中GAD67+與NeuN+神經(jīng)元的比例。
N. mPFC各個(gè)亞區(qū)中NeuN+神經(jīng)元的百分比。
Cg1：cingulate cortex, area 1；PrL：prelimbic cortex；IL：infralimbic cortex。
（4）妊娠期1-NP 暴露對胎兒前腦中間神經(jīng)元遷移的影響
圖5：妊娠期1-NP暴露對胎兒大腦中間神經(jīng)元遷移的影響
（5）妊娠期1-NP暴露對胎兒前腦神經(jīng)元遷移相關(guān)基因羥甲基化的影響
在妊娠期第14天（GD14）的胎兒前腦中，分析了妊娠期1-NP暴露對中間神經(jīng)元遷移相關(guān)基因中5-羥甲基胞嘧啶（5hmC）含量的影響。Nrg1、Erbb4和Sema3F基因的甲基化位點(diǎn)序列（圖6A），盡管Nrg1和Erbb4基因中富含CpG片段的5hmC水平在兩組間沒有差異，但在1-NP暴露的胎兒中，Sema3F基因的一個(gè)富集CpG片段的5hmC水平有所降低（圖6B）。隨后檢測了Nrg1、Erbb4和Sema3F基因CpG位點(diǎn)的5hmC含量（圖6C），在1-NP組胎兒前腦中，Nrg1基因的CpG位點(diǎn)（chr1:32009246）的5hmC含量減少。在1-NP組胎兒前腦中，Erbb4基因的兩個(gè)CpG位點(diǎn)（chr8: 69107743和69107866）的5hmC含量減少。而在1-NP組胎兒中，Sema3F基因的三個(gè)CpG位點(diǎn)（chr9: 107709269、107709348和107710238）的5hmC水平降低。在胎兒前腦中分析了三種DNA去甲基化酶TET1、TET2和TET3的活性。盡管1-NP并未影響TET1、TET2和TET3的表達(dá)（圖6D–F），但在1-NP組胎兒的前腦中，TETs酶的活性降低（圖6G）。
圖6：妊娠1-NP暴露對胎兒前腦中間神經(jīng)元遷移相關(guān)基因羥甲基化的影響。
（6）妊娠期1-NP暴露對胎兒前腦線粒體功能的影響
為研究1-NP暴露導(dǎo)致胎兒前腦中與中間神經(jīng)元遷移相關(guān)基因的羥甲基化變化以及抑制TET酶活性的原因，研究對妊娠第14天（GD14）的胎兒前腦進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析。KEGG和GO分析發(fā)現(xiàn)，1-NP導(dǎo)致前腦的線粒體相關(guān)代謝功能出現(xiàn)障礙，例如煙酸/煙酰胺代謝、類固醇生物合成和長鏈脂肪酸代謝（圖7A、B）�；贙EGG的基因集富集分析（GSEA）顯示，在1-NP暴露的胎兒前腦中，氧化磷酸化通路呈負(fù)向富集（圖7C）。基于GO的GSEA顯示，在1-NP暴露的胎兒前腦中線粒體電子傳遞鏈和氧化磷酸化通路呈負(fù)向富集（圖7D,E）。基于Reactome的GSEA顯示，三羧酸（TCA）循環(huán)和呼吸電子傳遞在1-NP暴露的胎兒前腦中呈負(fù)向富集（圖7F）。盡管線粒體面積沒有差異，但在1-NP暴露的胎兒前腦中，中間神經(jīng)元起源地神經(jīng)節(jié)隆起的線粒體嵴結(jié)構(gòu)消失（圖7G–I）。琥珀酸脫氫酶（SDH）B和vATP5A（兩種與氧化磷酸化相關(guān)的蛋白）在1-NP誘導(dǎo)的胎兒前腦中下調(diào)（圖7J–L）。最后線粒體α-酮戊二酸（α-KG）合成的關(guān)鍵酶IDH2和TET酶的輔因子α-KG，在1-NP組的胎兒前腦中減少（圖7M–O）。
圖7：妊娠期1-NP暴露對胎兒前腦線粒體功能的影響。
（7）補(bǔ)充α-KG對胎兒前腦中1-NP誘發(fā)的神經(jīng)元遷移相關(guān)基因低羥甲基化的影響
補(bǔ)充α-KG對1-NP引起的中間神經(jīng)元遷移相關(guān)基因低羥甲基化的影響（圖8A-F）。正如預(yù)期，妊娠期間補(bǔ)充α-KG抑制了1-NP引起的Nrg1基因中CpG位點(diǎn)（chr1: 32009246）的5hmC減少（圖8A）。此外，妊娠期間補(bǔ)充α-KG預(yù)防了1-NP引起的Sema3F基因一個(gè)CpG位點(diǎn)（chr9:107710238）的5hmC減少（圖8F）。補(bǔ)充α-KG可以保護(hù)1-NP誘導(dǎo)的Erbb4或其他Sema3F基因CpG位點(diǎn)的5hmC減少趨勢（圖8B–E）。分析α-KG對1-NP引起的中間神經(jīng)元遷移相關(guān)基因表達(dá)減少的影響（圖8G–I），結(jié)果表明，妊娠期間補(bǔ)充α-KG緩解了1-NP在胎兒前腦中引起的Sema3F、Nrg1和Erbb4減少（圖8G–I）。α-KG補(bǔ)充對1-NP引起的神經(jīng)元間遷移抑制的影響（圖8J、K）結(jié)果表明，妊娠期補(bǔ)充 α-KG 逆轉(zhuǎn)了 1-NP 導(dǎo)致前腦皮層中端和遠(yuǎn)端 GAD67 中間神經(jīng)元減少。
圖8：補(bǔ)充α-KG對1-NP誘發(fā)的胎兒前腦中間神經(jīng)元遷移相關(guān)基因的低羥基甲基化和中間神經(jīng)元遷移抑制的影響
（8）補(bǔ)充α-KG對1-NP誘導(dǎo)的中間神經(jīng)元遷移抑制的影響
圖9：妊娠期補(bǔ)充𝛼-KG對斷奶子代中間神經(jīng)元的影響
（9）補(bǔ)充α-KG對1-NP誘導(dǎo)的子代mIPSC傳遞障礙和自閉癥樣行為的影響
圖10：妊娠期補(bǔ)充𝛼-KG對1-NP誘導(dǎo)mIPSC傳遞障礙和自閉癥樣行為的影響
易小結(jié)
本研究利用小鼠模型進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，將懷孕小鼠分為不同劑量的1-NP暴露組。通過三室測試評估幼崽的ASD樣行為；使用膜片鉗技術(shù)檢測小鼠大腦前額葉皮層的抑制性突觸傳遞；通過免疫熒光技術(shù)檢測特定腦區(qū)的神經(jīng)元數(shù)量和遷移；利用ACE-seq和RNA-seq檢測與神經(jīng)元遷移相關(guān)的基因表達(dá)和DNA羥甲基化水平；最后通過補(bǔ)充α-酮戊二酸（𝛼-KG）來研究其對1-NP誘導(dǎo)的效應(yīng)的逆轉(zhuǎn)作用。
研究結(jié)果揭示了產(chǎn)前1-NP暴露導(dǎo)致斷奶期小鼠出現(xiàn)ASD樣行為。1-NP暴露減少了小鼠大腦前額葉皮層中抑制性突觸傳遞；減少了胎兒和斷奶幼崽前額葉中的谷氨酸脫羧酶67（GAD67）陽性神經(jīng)元數(shù)量；延緩了GAD67陽性神經(jīng)元的遷移，并下調(diào)了與神經(jīng)元遷移相關(guān)的基因表達(dá)；通過抑制TET酶活性降低了特定基因的羥甲基化水平。補(bǔ)充𝛼-KG能夠逆轉(zhuǎn)1-NP誘導(dǎo)的羥甲基化降低，并改善神經(jīng)元遷移延遲。母體補(bǔ)充𝛼-KG能夠改善1-NP誘導(dǎo)的幼崽ASD樣行為。
總之，本研究結(jié)果表明，產(chǎn)前1-NP暴露通過改變發(fā)育中大腦內(nèi)神經(jīng)元遷移相關(guān)基因的DNA羥甲基化，部分導(dǎo)致了ASD樣行為。𝛼-KG補(bǔ)充可能是一種用于減輕環(huán)境毒素引起的神經(jīng)發(fā)育障礙的潛在干預(yù)措施。本研究提供了關(guān)于環(huán)境污染物如何可能影響神經(jīng)發(fā)育和行為的新見解，并為預(yù)防和治療相關(guān)的神經(jīng)發(fā)育障礙提供了可能的策略。
參考文獻(xiàn)：
Zhao T, Huang CQ, Zhang YH, Zhu YY, Chen XX, Wang T, Shao J, Meng XH, Huang Y, Wang H, Wang HL, Wang B, Xu DX. Prenatal 1-Nitropyrene Exposure Causes Autism-Like Behavior Partially by Altering DNA Hydroxymethylation in Developing Brain. Adv Sci (Weinh). 2024 May 16:e2306294. doi: 10.1002/advs.202306294. PubMed PMID: 38757379.
越來越多證據(jù)表明內(nèi)側(cè)前額葉皮層（medial prefrontal cortex，mPFC）中的中間神經(jīng)元在社交溝通調(diào)節(jié)中發(fā)揮關(guān)鍵作用，中間神經(jīng)元遷移遲緩導(dǎo)致小鼠出現(xiàn)自閉癥樣行為。一些研究表明，羥甲基化修飾參與胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞和神經(jīng)干細(xì)胞遷移。那么產(chǎn)前1-NP暴露是否會(huì)通過抑制與中間神經(jīng)元遷移相關(guān)基因的羥甲基化修飾來抑制中間神經(jīng)元遷移呢？
2024年5月16日，安徽醫(yī)科大學(xué)碩士研究生趙婷為第一作者、合肥工業(yè)大學(xué)黃程青博士和安徽醫(yī)科大學(xué)張醫(yī)浩副教授為共同第一作者，安徽醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院徐德祥教授為通訊作者、王博副教授為共同通訊在《Advanced Science》（Adv Sci）期刊發(fā)表題為“Prenatal 1-Nitropyrene Exposure Causes Autism-Like Behavior Partially by Altering DNA Hydroxymethylation in Developing Brain”的研究論文，研究通過APOBEC-coupled epigenetic sequencing（ACE-seq）和RNA-seq多組學(xué)分析揭示了母體孕期1-NP暴露會(huì)通過改變發(fā)育大腦中與中間神經(jīng)元遷移相關(guān)的DNA羥甲基化調(diào)控下游基因表達(dá)，進(jìn)而介導(dǎo)子代出現(xiàn)自閉癥樣行為表型。此外，研究還表明補(bǔ)充α-酮戊二酸（α-KG，TET酶的輔因子），可以逆轉(zhuǎn)1-NP誘導(dǎo)的中間神經(jīng)元遷移相關(guān)基因特定位點(diǎn)的低羥甲基化，緩解中間神經(jīng)元遷移延遲并改善由1-NP引起的自閉癥。
標(biāo)題：Prenatal 1-Nitropyrene Exposure Causes Autism-Like Behavior Partially by Altering DNA Hydroxymethylation in Developing Brain（產(chǎn)前1-硝基芘暴露通過腦發(fā)育過程中DNA羥甲基化變化誘導(dǎo)子代自閉癥樣行為）
期刊：Advanced Science
影響因子：IF 14.3 / Q1
技術(shù)平臺(tái)：ACE-seq（易基因優(yōu)勢技術(shù)）、RNA-seq、行為評估、細(xì)胞功能分析等
研究摘要：
本研究旨在研究產(chǎn)前暴露于1-硝基芘（1-NP）對小鼠模型中自閉癥樣行為的影響。三室社交互動(dòng)測試結(jié)果表明，產(chǎn)前1-NP暴露在斷奶期間引起自閉癥樣行為。膜片鉗技術(shù)顯示，在1-NP暴露的斷奶幼崽內(nèi)側(cè)前額葉皮層中的抑制性突觸傳遞減少。免疫熒光顯示，產(chǎn)前1-NP暴露減少了胎兒和斷奶幼崽前額葉中谷氨酸脫羧酶67（GAD67）陽性的中間神經(jīng)元數(shù)量。此外，產(chǎn)前1-NP暴露導(dǎo)致GAD67陽性中間神經(jīng)元遷移延遲，并下調(diào)胎兒前腦與中間神經(jīng)元遷移相關(guān)的基因，如Nrg1、Erbb4和Sema3F。從機(jī)制上講，產(chǎn)前1-NP暴露通過抑制胎兒前腦中的TET活性，以誘導(dǎo)中間神經(jīng)元遷移相關(guān)基因的羥甲基化降低。補(bǔ)充α-KG（TET酶輔因子）可以逆轉(zhuǎn)1-NP誘導(dǎo)的中間神經(jīng)元遷移相關(guān)基因特定位點(diǎn)的低羥甲基化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，α-KG補(bǔ)充劑緩解了胎兒前腦中1-NP誘導(dǎo)的中間神經(jīng)元遷移延遲；母體α-KG補(bǔ)充劑改善了斷奶子代中1-NP誘導(dǎo)的自閉癥樣行為�？傊�，產(chǎn)前1-NP暴露可以通過發(fā)育中大腦中間神經(jīng)元遷移相關(guān)基因的DNA羥甲基化變化，而引起自閉癥樣行為。
實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：
30只懷孕小鼠隨機(jī)分為3組，分別給予不同劑量的1-NP（0、10、100μg/kg）；后續(xù)實(shí)驗(yàn)懷孕小鼠分為不同的處理組：對照組、1-NP暴露組、α-KG補(bǔ)充組以及1-NP+α-KG聯(lián)合組。產(chǎn)前在指定時(shí)間點(diǎn)收集胎兒前腦樣本；產(chǎn)后在指定時(shí)間點(diǎn)收集子代前額葉皮質(zhì)(mPFC)樣本。用于后續(xù)的行為評估、DNA羥甲基化檢測（ACE-seq）、TET酶活性檢測、α-KG水平檢測、RNA測序（RNA-seq）與RT-PCR驗(yàn)證、細(xì)胞功能分析等實(shí)驗(yàn)。
圖1：動(dòng)物和處理的實(shí)驗(yàn)方案
結(jié)果圖形：
（1）母體 1-NP 暴露對子代自閉癥樣行為的影響
圖2：母體1-NP暴露對斷奶子代自閉癥樣行為的影響。30只懷孕小鼠從妊娠第0天（GD0）到第17天（GD17）每天口服接受不同劑量的1-NP（0,10, 100 µg/kg）。所有懷孕的小鼠都自然分娩。
A–F) 使用三室社交互動(dòng)測試來評估斷奶子代（PND28）的自閉癥樣行為。
G–L) 使用三室社交互動(dòng)測試來評估成年子代（PND70）的自閉癥樣行為。
（2）母體1-NP暴露對子代mPFC中微小抑制性后神經(jīng)突觸電流（miniature inhibitory postsynaptic current，mIPSC）的影響
圖3：母體1-NP暴露對子代mIPSC的影響。
G–L) 對成年子代（PND70）的興奮性神經(jīng)元進(jìn)行膜片鉗實(shí)驗(yàn)，以測量mPFC中的mIPSC。每組樣本量（N）為3只小鼠的12個(gè)興奮性神經(jīng)元。
（3）孕期母體1-NP暴露對斷奶子代mPFC中GAD67+中間神經(jīng)元的影響
圖4：母體1-NP暴露對斷奶子代GAD67中間神經(jīng)元的影響。
A-B. Western blot檢測GAD67。
C-D. Western blot檢測NeuN。
E. 免疫熒光（IF）分析mPFC各個(gè)亞區(qū)的GAD67+和NeuN+神經(jīng)元。
F. mPFC各個(gè)亞區(qū)中GAD67+與NeuN+神經(jīng)元的比例。
G. mPFC各個(gè)亞區(qū)中NeuN+神經(jīng)元的百分比。
H–N) 雌性子代在PND28被安樂死，并且收集其mPFC。
H-I. Western blot檢測GAD67。
J-K. Western blot檢測NeuN。
L. 免疫熒光分析mPFC各個(gè)亞區(qū)的GAD67+和NeuN+神經(jīng)元。
M. mPFC各個(gè)亞區(qū)中GAD67+與NeuN+神經(jīng)元的比例。
N. mPFC各個(gè)亞區(qū)中NeuN+神經(jīng)元的百分比。
Cg1：cingulate cortex, area 1；PrL：prelimbic cortex；IL：infralimbic cortex。
（4）妊娠期1-NP 暴露對胎兒前腦中間神經(jīng)元遷移的影響
圖5：妊娠期1-NP暴露對胎兒大腦中間神經(jīng)元遷移的影響
在妊娠期第14天（GD14）的胎兒前腦中，分析了妊娠期1-NP暴露對中間神經(jīng)元遷移相關(guān)基因中5-羥甲基胞嘧啶（5hmC）含量的影響。Nrg1、Erbb4和Sema3F基因的甲基化位點(diǎn)序列（圖6A），盡管Nrg1和Erbb4基因中富含CpG片段的5hmC水平在兩組間沒有差異，但在1-NP暴露的胎兒中，Sema3F基因的一個(gè)富集CpG片段的5hmC水平有所降低（圖6B）。隨后檢測了Nrg1、Erbb4和Sema3F基因CpG位點(diǎn)的5hmC含量（圖6C），在1-NP組胎兒前腦中，Nrg1基因的CpG位點(diǎn)（chr1:32009246）的5hmC含量減少。在1-NP組胎兒前腦中，Erbb4基因的兩個(gè)CpG位點(diǎn)（chr8: 69107743和69107866）的5hmC含量減少。而在1-NP組胎兒中，Sema3F基因的三個(gè)CpG位點(diǎn)（chr9: 107709269、107709348和107710238）的5hmC水平降低。在胎兒前腦中分析了三種DNA去甲基化酶TET1、TET2和TET3的活性。盡管1-NP并未影響TET1、TET2和TET3的表達(dá)（圖6D–F），但在1-NP組胎兒的前腦中，TETs酶的活性降低（圖6G）。
圖6：妊娠1-NP暴露對胎兒前腦中間神經(jīng)元遷移相關(guān)基因羥甲基化的影響。
（6）妊娠期1-NP暴露對胎兒前腦線粒體功能的影響
為研究1-NP暴露導(dǎo)致胎兒前腦中與中間神經(jīng)元遷移相關(guān)基因的羥甲基化變化以及抑制TET酶活性的原因，研究對妊娠第14天（GD14）的胎兒前腦進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析。KEGG和GO分析發(fā)現(xiàn)，1-NP導(dǎo)致前腦的線粒體相關(guān)代謝功能出現(xiàn)障礙，例如煙酸/煙酰胺代謝、類固醇生物合成和長鏈脂肪酸代謝（圖7A、B）�；贙EGG的基因集富集分析（GSEA）顯示，在1-NP暴露的胎兒前腦中，氧化磷酸化通路呈負(fù)向富集（圖7C）。基于GO的GSEA顯示，在1-NP暴露的胎兒前腦中線粒體電子傳遞鏈和氧化磷酸化通路呈負(fù)向富集（圖7D,E）。基于Reactome的GSEA顯示，三羧酸（TCA）循環(huán)和呼吸電子傳遞在1-NP暴露的胎兒前腦中呈負(fù)向富集（圖7F）。盡管線粒體面積沒有差異，但在1-NP暴露的胎兒前腦中，中間神經(jīng)元起源地神經(jīng)節(jié)隆起的線粒體嵴結(jié)構(gòu)消失（圖7G–I）。琥珀酸脫氫酶（SDH）B和vATP5A（兩種與氧化磷酸化相關(guān)的蛋白）在1-NP誘導(dǎo)的胎兒前腦中下調(diào)（圖7J–L）。最后線粒體α-酮戊二酸（α-KG）合成的關(guān)鍵酶IDH2和TET酶的輔因子α-KG，在1-NP組的胎兒前腦中減少（圖7M–O）。
圖7：妊娠期1-NP暴露對胎兒前腦線粒體功能的影響。
（7）補(bǔ)充α-KG對胎兒前腦中1-NP誘發(fā)的神經(jīng)元遷移相關(guān)基因低羥甲基化的影響
補(bǔ)充α-KG對1-NP引起的中間神經(jīng)元遷移相關(guān)基因低羥甲基化的影響（圖8A-F）。正如預(yù)期，妊娠期間補(bǔ)充α-KG抑制了1-NP引起的Nrg1基因中CpG位點(diǎn)（chr1: 32009246）的5hmC減少（圖8A）。此外，妊娠期間補(bǔ)充α-KG預(yù)防了1-NP引起的Sema3F基因一個(gè)CpG位點(diǎn)（chr9:107710238）的5hmC減少（圖8F）。補(bǔ)充α-KG可以保護(hù)1-NP誘導(dǎo)的Erbb4或其他Sema3F基因CpG位點(diǎn)的5hmC減少趨勢（圖8B–E）。分析α-KG對1-NP引起的中間神經(jīng)元遷移相關(guān)基因表達(dá)減少的影響（圖8G–I），結(jié)果表明，妊娠期間補(bǔ)充α-KG緩解了1-NP在胎兒前腦中引起的Sema3F、Nrg1和Erbb4減少（圖8G–I）。α-KG補(bǔ)充對1-NP引起的神經(jīng)元間遷移抑制的影響（圖8J、K）結(jié)果表明，妊娠期補(bǔ)充 α-KG 逆轉(zhuǎn)了 1-NP 導(dǎo)致前腦皮層中端和遠(yuǎn)端 GAD67 中間神經(jīng)元減少。
（8）補(bǔ)充α-KG對1-NP誘導(dǎo)的中間神經(jīng)元遷移抑制的影響
圖9：妊娠期補(bǔ)充𝛼-KG對斷奶子代中間神經(jīng)元的影響
（9）補(bǔ)充α-KG對1-NP誘導(dǎo)的子代mIPSC傳遞障礙和自閉癥樣行為的影響
圖10：妊娠期補(bǔ)充𝛼-KG對1-NP誘導(dǎo)mIPSC傳遞障礙和自閉癥樣行為的影響
易小結(jié)
本研究利用小鼠模型進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，將懷孕小鼠分為不同劑量的1-NP暴露組。通過三室測試評估幼崽的ASD樣行為；使用膜片鉗技術(shù)檢測小鼠大腦前額葉皮層的抑制性突觸傳遞；通過免疫熒光技術(shù)檢測特定腦區(qū)的神經(jīng)元數(shù)量和遷移；利用ACE-seq和RNA-seq檢測與神經(jīng)元遷移相關(guān)的基因表達(dá)和DNA羥甲基化水平；最后通過補(bǔ)充α-酮戊二酸（𝛼-KG）來研究其對1-NP誘導(dǎo)的效應(yīng)的逆轉(zhuǎn)作用。
研究結(jié)果揭示了產(chǎn)前1-NP暴露導(dǎo)致斷奶期小鼠出現(xiàn)ASD樣行為。1-NP暴露減少了小鼠大腦前額葉皮層中抑制性突觸傳遞；減少了胎兒和斷奶幼崽前額葉中的谷氨酸脫羧酶67（GAD67）陽性神經(jīng)元數(shù)量；延緩了GAD67陽性神經(jīng)元的遷移，并下調(diào)了與神經(jīng)元遷移相關(guān)的基因表達(dá)；通過抑制TET酶活性降低了特定基因的羥甲基化水平。補(bǔ)充𝛼-KG能夠逆轉(zhuǎn)1-NP誘導(dǎo)的羥甲基化降低，并改善神經(jīng)元遷移延遲。母體補(bǔ)充𝛼-KG能夠改善1-NP誘導(dǎo)的幼崽ASD樣行為。
總之，本研究結(jié)果表明，產(chǎn)前1-NP暴露通過改變發(fā)育中大腦內(nèi)神經(jīng)元遷移相關(guān)基因的DNA羥甲基化，部分導(dǎo)致了ASD樣行為。𝛼-KG補(bǔ)充可能是一種用于減輕環(huán)境毒素引起的神經(jīng)發(fā)育障礙的潛在干預(yù)措施。本研究提供了關(guān)于環(huán)境污染物如何可能影響神經(jīng)發(fā)育和行為的新見解，并為預(yù)防和治療相關(guān)的神經(jīng)發(fā)育障礙提供了可能的策略。
參考文獻(xiàn)：
Zhao T, Huang CQ, Zhang YH, Zhu YY, Chen XX, Wang T, Shao J, Meng XH, Huang Y, Wang H, Wang HL, Wang B, Xu DX. Prenatal 1-Nitropyrene Exposure Causes Autism-Like Behavior Partially by Altering DNA Hydroxymethylation in Developing Brain. Adv Sci (Weinh). 2024 May 16:e2306294. doi: 10.1002/advs.202306294. PubMed PMID: 38757379.
標(biāo)簽：
DNA甲基化
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