替米考星檢測試劑盒使用說明書

 
1、 原理及用途
本試劑盒采用間接競爭ELISA方法檢測組織、蜂蜜等樣本中的鏈霉素（Streptomycin，SM），試劑盒由預(yù)包被偶聯(lián)抗原的酶標(biāo)板、酶標(biāo)記物、抗體、標(biāo)準(zhǔn)品及其他配套試劑組成。檢測時，加入標(biāo)準(zhǔn)品或樣本溶液，樣本中的鏈霉素和酶標(biāo)板上預(yù)包被偶聯(lián)抗原競爭抗鏈霉素抗體，加入酶標(biāo)記物后，用TMB底物顯色，樣本吸光度值與其所含鏈霉素含量成負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出樣本中鏈霉素的殘留量。

2、 技術(shù)指標(biāo)
2.1 試劑盒靈敏度：0.1ppb(ng/ml)
2.2 反應(yīng)模式：25℃，30min～30min～15min
2.3 檢測下限：
組織………………………………4ppb
蜂蜜………………………………2ppb
牛奶、奶粉………………………5ppb
禽蛋………………………………10ppb
2.4 交叉反應(yīng)率：
鏈霉素……………………………100%
雙氫鏈霉素………………………100%
卡拉霉素…………………………6.3%
慶大霉素…………………………2.5%
 2.5 樣本回收率：
組織、蜂蜜、牛奶、禽蛋………85±15%

3、 試劑盒組成
酶標(biāo)板……………………………96孔
標(biāo)準(zhǔn)品：各1ml
0ppb、0.1ppb、0.3ppb、0.9ppb、2.7ppb、8.1ppb
高標(biāo)準(zhǔn)品（紅蓋）：1ppm…………1ml
酶標(biāo)記物（紅蓋）……………………11ml
抗體工作液（藍(lán)蓋）…………………5.5ml
底物液A（白蓋）……………………6ml
底物液B（黑蓋）……………………6ml
終止液（黃蓋）………………………6ml
20X濃縮洗滌液（白蓋）……………40ml
5X復(fù)溶液（黃蓋） …………………50ml
說明書…………………………………1份
蓋板膜…………………………………1張
自封袋…………………………………1個

4、 需要的器材和試劑
4.1 儀器：酶標(biāo)儀、打印機(jī)、均質(zhì)器 、氮氣吹干裝置、振蕩器、離心機(jī)、刻度移液管、天平（感量0.01g）
4.2 微量移液器：單道20µl-200µl，100µl-1000µl、多道300µl
4.3 試劑：NaOH、Na₂HPO₄·12H₂O、NaH₂PO₄·2H₂O、正己烷、磷酸、冰醋酸、甲醇

5、 樣本前處理
5.1 樣本處理前須知：
實驗器具必須潔凈并使用一次性吸頭，以避免污染干擾實驗結(jié)果。
5.2 配液：
配液1：0.05M  PB緩沖液
    稱取12.9g Na₂HPO₄·12H₂O和2.175g NaH₂PO₄·2H₂O加去離子水混勻溶解，定容至1000ml。
配液2：0.04M磷酸（蜂蜜樣本專用）
    1ml濃磷酸加去離子水混勻，定容至360ml。
配液3：1M NaOH（蜂蜜樣本專用）
    稱取4g NaOH加去離子水混勻溶解，定容至100ml。
配液4：1% 冰醋酸（禽蛋樣本專用）
量取1ml冰醋酸加去離子水99ml混勻溶解。
配液5：70% 甲醇（禽蛋樣本專用）
    量取700ml甲醇加去離子水300ml混勻溶解。
配液6：復(fù)溶液
將5×復(fù)溶液用去離子水5倍稀釋（1份復(fù)溶液加4份水），用于樣本的復(fù)溶，復(fù)溶液在4℃環(huán)境可保存一個月。
配液5:工作洗滌液
    將濃縮洗滌液20倍稀釋(1份洗滌液加19份去離子水)。
5.3 樣本前處理步驟：
5.3.1 組織樣本
1）稱取2±0.05g去除脂肪的勻漿樣本，加入8ml 0.05M PB緩沖液，振蕩5min，置56℃水浴環(huán)境放置30min；
2）室溫4000r/min以上離心10min；
3）取1ml上清液加入1ml正己烷，充分混勻，室溫4000r/min以上離心5min；
4）去除上層有機(jī)相，取50ul下層液，加入450ul 稀釋后的復(fù)溶液，混合30s；
5）取50ul用于分析。
    樣本稀釋倍數(shù)：40     檢測下限：4ppb
5.3.2 蜂蜜、蜂王漿
1）稱取2±0.05g 樣本，加入4ml 0.04M磷酸，振蕩至完全溶解，室溫4000r/min以上離心5min，直至清亮。（蜂蜜樣本可不用離心直接進(jìn)行第2步）；
2）加入450ul 1M NaOH將PH值調(diào)至7-9之間(蜂王漿樣本需將全部上清移至另一干凈離心管中調(diào)節(jié)PH值至7-9之間)，室溫4000r/min以上離心5min ，直至清亮；
3）取50ul上清液，加入450ul稀釋后的復(fù)溶液混勻，混合30s；
4）取50ul用于分析。
    樣本稀釋倍數(shù)：20     檢測下限：2ppb
5.3.3 牛奶、奶粉
1）稱取2±0.05g樣本，加入8ml 0.05M PB緩沖液，振蕩5min，置56℃水浴環(huán)境放置30min；
2）室溫4000r/min以上離心10min；
3）去除上層脂肪，取50ul中層澄清液體，加入450ul 稀釋后的復(fù)溶液，混合30s；
4）取50ul用于分析。
    樣本稀釋倍數(shù)：50     檢測下限：5ppb
5.3.4 禽蛋
1）將禽蛋去皮打破后均質(zhì)，取1g±0.05g于50ml離心管中，先加入體積分?jǐn)?shù)為1%的冰醋酸2ml，振蕩2分鐘，再加入體積分?jǐn)?shù)為70%的甲醇7ml，振蕩2分鐘，室溫4000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘；
2）取上層液0.1ml于1.5ml離心管中，加入0.9ml復(fù)溶液，振蕩混勻30s，取50ul分析。
樣本稀釋倍數(shù)：100    檢測下限：10ppb

6、 酶聯(lián)免疫試驗步驟
將所需試劑從4℃冷藏環(huán)境中取出，置于室溫平衡30min以上, 洗滌液冷藏時可能會有結(jié)晶需恢復(fù)到室溫以充分溶解，每種液體試劑使用前均須搖勻。取出需要數(shù)量的微孔板及框架，將不用的微孔板放入自封袋，保存于2-8℃。
6.1 編    號：將樣本和標(biāo)準(zhǔn)品對應(yīng)微孔按序編號，每個樣本和標(biāo)準(zhǔn)品做2孔平行，并記錄標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔所在的位置。
6.2 加樣反應(yīng)：加標(biāo)準(zhǔn)品或樣本50µl/孔到各自的微孔中，然后加抗體工作液50µl/孔，輕輕振蕩5秒混勻，25℃避光反應(yīng)30分鐘。
6.3 洗    滌：小心揭開蓋板膜，甩去孔內(nèi)液體，每孔加350ul工作洗滌液，靜置30秒后棄去，重復(fù)洗滌5次，最后一次拍干。（用吸水紙拍干，拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）。
6.4 加酶反應(yīng)：加酶標(biāo)記物100µl/孔，25℃避光反應(yīng)30分鐘。
6.5 洗    滌：同上
6.6 顯    色：加底物液A 50µl/孔，再加底物液B 50µl/孔，輕輕振蕩5秒混勻，25℃避光顯色15分鐘（若藍(lán)色過淺，可適當(dāng)延長反應(yīng)時間）。
6.7 終    止：加終止液50µl/孔，輕輕振蕩混勻，終止反應(yīng)。
6.8 測吸光值：用酶標(biāo)儀于450nm處測定每孔吸光度值（建議用雙波長450/630nm）。測定應(yīng)在終止反應(yīng)后10分鐘內(nèi)完成。

7、 結(jié)果分析
7.1 百分吸光率的計算
    標(biāo)準(zhǔn)液或樣本的百分吸光率等于標(biāo)準(zhǔn)液或樣本的百分吸光度值的平均值（雙孔）除以第一個標(biāo)準(zhǔn)液（0ppb）的吸光度值，再乘以100%，即

百分吸光度值（%）＝	A	×100%
	A0

A—標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值
A0—0ppb標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值
7.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與計算
    以標(biāo)準(zhǔn)液百分吸光率為縱坐標(biāo)，對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)液濃度（ppb）的對數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)液的半對數(shù)曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本所對應(yīng)的濃度，乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中待測物的實際濃度。
    若利用試劑盒專業(yè)分析軟件進(jìn)行計算，更便于大量樣本的準(zhǔn)確、快速分析。（歡迎來電索�。�

8、 注意事項
8.1 室溫低于25℃或試劑及樣本沒有回到室溫（25℃）會導(dǎo)致所有標(biāo)準(zhǔn)的OD值偏低。
8.2 在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況，則會出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線不成線性，重復(fù)性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應(yīng)立即進(jìn)行下一步操作。
8.3 混合要均勻，洗板要徹底，在ELISA分析中的再現(xiàn)性，很大程度上取決于洗板的一致性。
8.4 在所有孵育過程中，用蓋板膜封住微孔板，避免光線照射。
8.5 不要使用過了有效期的試劑盒，不要交換使用不同批號試劑盒中的試劑。
8.6 顯色液若有任何顏色表明變質(zhì)，應(yīng)當(dāng)棄之。0標(biāo)準(zhǔn)的吸光度值小于0.5個單位（A450nm< 0.5 ）時，表示試劑可能變質(zhì)。
8.7 反應(yīng)終止液有腐蝕性，避免接觸皮膚。

9、 貯藏及保存期
儲藏條件：試劑盒于2-8℃保存，避免冷凍。
保 質(zhì) 期：該產(chǎn)品有效期為1年，生產(chǎn)日期見包裝盒。