PCR進(jìn)階：GC-Rich片段的擴(kuò)增策略詳解

前言

PCR擴(kuò)增不出來?xiàng)l帶的原因有很多，諸如引物設(shè)計(jì)有誤，DNA模板已降解，酶失活或者有雜酶污染，緩沖液條件不當(dāng)，模板DNA的GC含量太高等等。大部分原因可以通過換試劑得到解決，但是對于高GC含量的樣本，擴(kuò)增起來始終是有難度。

模板GC含量高就難以擴(kuò)增的原因在于G、C之間形成三對氫鍵，解鏈所需能量較高，故模板較難打開，在常規(guī)變性溫度下，DNA模板變性不完全，同時(shí)由于單鏈的G＋C豐富區(qū)易于自身互補(bǔ)配對形成穩(wěn)定的發(fā)夾環(huán)二級結(jié)構(gòu)，而使PCR引物難以結(jié)合到模板上。

目前，研究學(xué)者建立了各種不同的方法來解決高GC含量DNA模板擴(kuò)增困難的問題。常用的方法包括：

1、添加增強(qiáng)劑，如甘油、DMSO等，有助于打開復(fù)雜二級結(jié)構(gòu)；

2、提高變性溫度，比如96度5分鐘然后再加熱啟動酶；

3、降落PCR，在PCR循環(huán)過程中逐步降低退火溫度，從而在初始階段提高退火溫度, 減少非特異性結(jié)合，提高特異性擴(kuò)增；

4、提高PCR擴(kuò)增儀的瞬時(shí)功率，利用更大的能量打開DNA的二級結(jié)構(gòu)，從而提高PCR反應(yīng)的效率‌。

PCR技術(shù)不斷發(fā)展, 高功率PCR擴(kuò)增儀已作為一項(xiàng)新型技術(shù)，逐漸被應(yīng)用于解決GC含量高的DNA模板擴(kuò)增難題。這種儀器通過提供更強(qiáng)的熱循環(huán)能力，能夠有效地打開DNA的二級結(jié)構(gòu)，特別適合于高GC含量的樣本擴(kuò)增。

艾普拜生物重磅推出精衛(wèi)自動PCR儀, 瞬時(shí)功率可達(dá)750W, 不僅提高了復(fù)雜樣本擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)的成功率，還大大縮短了實(shí)驗(yàn)時(shí)間，為研究人員提供了強(qiáng)而有力的科研工具。

精衛(wèi)自動PCR儀的優(yōu)勢：

1、更高效的熱循環(huán): 高功率可以減少達(dá)到變性溫度所需的時(shí)間，使模板能夠充分變性，為后續(xù)的引物結(jié)合和延伸步驟創(chuàng)造良好條件。

2、均勻的熱傳遞: 高功率 PCR 儀能夠提供更均勻的加熱，避免部分模板無法完全變性或引物結(jié)合不充分導(dǎo)致擴(kuò)增不成功，提高反應(yīng)的穩(wěn)定性和重復(fù)性。

3、適應(yīng)高難度的PCR反應(yīng): 在一些特殊的 PCR 應(yīng)用中，如長片段DNA 、高 GC 含量的樣本擴(kuò)增、復(fù)雜二級結(jié)構(gòu)等。

4、減少溫度波動: 對于高 GC 含量的模板，溫度的微小波動可能會影響 DNA 雙鏈的穩(wěn)定性和引物的結(jié)合效率，高功率 PCR 儀可以更好地維持溫度的穩(wěn)定性，保證高 GC 片段的順利擴(kuò)增。

應(yīng)用案例：

儀器：Kingwell 96，高GC含量，反應(yīng)體系：10ul