中國(guó)首例基于英國(guó)kirkstall類器官技術(shù)用于精準(zhǔn)醫(yī)療的案例分享

一）摘 要
基于腫瘤類器官的藥物敏感性預(yù)測(cè)是一種新的精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)方法，在癌癥治療中有著廣泛的應(yīng)用，并受到越來越多的關(guān)注。在癌癥領(lǐng)域，傳統(tǒng)的類器官培養(yǎng)方法通常需要超過2周~3周的培養(yǎng)期。培養(yǎng)時(shí)間極大地限制了腫瘤類器官應(yīng)用和患者的臨床診療黃金期。
 
全國(guó)建院較早的六所腫瘤醫(yī)院之一，山西省腫瘤醫(yī)院/中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院山西醫(yī)院/山西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院和自貢第四人民醫(yī)院等，應(yīng)用了英國(guó)Kirkstall動(dòng)態(tài)類器官培養(yǎng)微生理系統(tǒng)，以縮短乳腺癌類器官的培養(yǎng)時(shí)間，同時(shí)保持其組織學(xué)特性和藥物敏感性特征。
 
（二）研 究 發(fā) 現(xiàn)
利用奧拉帕尼、卡培他濱、順鉑、吉西他濱、戈沙妥珠單抗（SN-38替代品）和法瑪新藥物霉素對(duì)Dome組類器官進(jìn)行藥物刺激研究。三種類器官模型顯示對(duì)藥物霉素敏感，并顯示了人類使用的良好治療結(jié)果。其中，BC1和BC2患者在乳房切除術(shù)后給予藥物阿霉素化療，隨訪10個(gè)月時(shí)未發(fā)現(xiàn)腫瘤復(fù)發(fā)。BC3患者采用藥物霉素進(jìn)行新輔助治療，治療6個(gè)周期后，腫瘤大小從2.41*1.91 cm到1.46*1.24 cm。
（三）乳腺癌類器官的培養(yǎng)關(guān)鍵實(shí)驗(yàn)步驟
1. 組織收集：
- 從三名患有浸潤(rùn)性導(dǎo)管乳腺癌的患者身上獲取腫瘤組織樣本。
- 樣本采集經(jīng)山西省級(jí)癌癥醫(yī)院倫理委員會(huì)審查和批準(zhǔn)（記錄號(hào)KY2023039）。
- 所有研究方法均使用獲批的方法進(jìn)行。
- 所有樣本的收集均獲得了患者的書面知情同意，并符合所有相關(guān)的倫理規(guī)定，包括赫爾辛基宣言。
- 組織樣本在處理和分析前進(jìn)行了去標(biāo)識(shí)化處理。
2. 建立和培養(yǎng)乳腺癌類器官：
- 從組織中去除明顯的結(jié)締組織，從視覺上異常的區(qū)域切取一塊組織用于石蠟包埋。
- 將剩余組織切成大約1mm³的小塊，并使用含有10µM Y-27632和2mg/mL I型膠原酶的先進(jìn)DMEM/F12在37°C恒溫?fù)u床中分散。
- 搖動(dòng)30分鐘到1小時(shí)，期間每5到10分鐘用Pasteur吸管吹打幾次。
- 向收集的濾液中加入等體積的含有2% FCS的先進(jìn)DMEM/F12。
- 離心后，用Matrigel重懸細(xì)胞沉淀，并在24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中每滴40µL進(jìn)行接種。
- 在37°C下孵育20分鐘，待滴液完全固化后，加入500µL的乳腺癌類器官培養(yǎng)基（KCJ-7, KINGBIO）并繼續(xù)在37°C 5%CO2條件下培養(yǎng)。
- 每3天更換一次培養(yǎng)基。
- 每7-15天消化并傳代一次，使用Dispase II（17105041, Gibco）回收類器官，并使用Accutase（A1110501, Gibco）將類器官解離成單細(xì)胞。
3. 實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備：
- 實(shí)驗(yàn)所用的乳腺癌類器官應(yīng)高于兩代且低于五代。
- 使用英國(guó)Kirkstall Quasi Vivo® 動(dòng)態(tài)系統(tǒng)進(jìn)行流體培養(yǎng)。
- 實(shí)驗(yàn)前將類器官解離成單細(xì)胞，并在每100µL Matrigel中接種20000個(gè)細(xì)胞。
4. 免疫組化染色：
- 使用常規(guī)方法進(jìn)行組織和類器官的固定、石蠟包埋、切片、HE染色和IHC染色。
- 用于免疫組化染色的抗體包括PR（Abcam, ab32085）、ER（Abcam, ab108398）、HER2（Abcam, ab134182）、CK7（Abcam, ab181598）、GATA3（Abcam, ab199428）、E-cadherin（Abcam, ab40772）、Ki-67（Abcam, ab15580）。
- 使用Nikon ECLIPSE E100顯微鏡MshOt MS60獲取圖像，并使用Adobe Photoshop進(jìn)行圖像處理。
5. 基因表達(dá)分析：
- 通過RT-qPCR測(cè)量基因表達(dá)水平。
- 使用Trizol（beyotime, R0016）提取總RNA，使用PrimeScript RT Master Mix（TaKaRa, RR036A）進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，并使用TB Green Advantage qPCR premixes（TaKaRa, 639676）進(jìn)行qPCR反應(yīng)。
6. 類器官增殖實(shí)驗(yàn)：
- 使用Alamar Blue（YEASEN, 40202ES80）進(jìn)行類器官增殖實(shí)驗(yàn)。
- 將染料溶液按比例加入類器官培養(yǎng)基中，反應(yīng)時(shí)間為3小時(shí)。
- 在檢測(cè)期間，將染料溶液移入96孔板中，使用無內(nèi)容物的凝膠滴在24孔板中作為陰性對(duì)照進(jìn)行染色，并使用100%降低的Alamar Blue溶液作為陽性對(duì)照。
- 讀取595nm和630nm處的吸光度值，并根據(jù)制造商的說明計(jì)算降低率。
7. 類器官直徑測(cè)量：
- 隨機(jī)選擇100倍視野下的3個(gè)視野，測(cè)量并計(jì)數(shù)視野內(nèi)所有清晰可見的類器官。
- 每5天測(cè)量一次。
8. 藥物篩選：
- 使用CellTiter-Glo（Promega, G9241）對(duì)類器官進(jìn)行藥物敏感性分析。
- 這些藥物包括奧拉帕尼（HY-10162, MCE）、卡培他濱（5'-氟尿嘧啶替代品）（100187, National Institutes for Food and Drug Contro）、順鉑（S1166, selleck）、吉西他濱（100622, National Institutes for Food and Drug Contro）、（HY-13704, MCE）和（130560, National Institutes for Food and Drug Contro）。
- 使用Dispase II收集類器官。使用Accutase將類器官消化成單細(xì)胞。
- 在含有5% Matrigel的類器官培養(yǎng)基的384孔板中每孔接種1,000個(gè)細(xì)胞。
- 培養(yǎng)過夜后，加入藥物庫存溶液。
- 藥物孵育3天后，使用CellTiter-Glo檢測(cè)法根據(jù)制造商的說明定量細(xì)胞活性。
9. 統(tǒng)計(jì)分析：
- 數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。使用Shapiro-Wilk檢驗(yàn)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)。
- 使用雙尾學(xué)生t檢驗(yàn)、Wilcoxon檢驗(yàn)和Kruskal-Wallis檢驗(yàn)進(jìn)行比較分析。
- p < 0.05表示顯著，除非另有說明。
- 星號(hào)數(shù)量表示不同程度的統(tǒng)計(jì)顯著性（*p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001）。
- 所有數(shù)據(jù)分析和圖形均使用GraphPad Prism 8進(jìn)行。
這些步驟概述了從樣本收集到類器官培養(yǎng)、藥物篩選和數(shù)據(jù)分析的全過程。參考文獻(xiàn)：Jun Yang et al.Posted Date: March 15th, 2024 .DOI: https://doi.org/10.21203/rs.3.rs-3923138/v1
（四）討論與展望

 
在這篇文章中，作者闡述了microfluidic systems在癌癥類器官培養(yǎng)中的應(yīng)用，這些應(yīng)用展示了動(dòng)態(tài)仿生類器官培養(yǎng)系統(tǒng)在癌癥研究和治療開發(fā)中的潛力，特別是在模擬復(fù)雜的腫瘤微環(huán)境和進(jìn)行個(gè)性化醫(yī)療方面。
1. 模擬腫瘤微環(huán)境：動(dòng)態(tài)仿生類器官培養(yǎng)系統(tǒng)能夠創(chuàng)建一個(gè)模擬體內(nèi)腫瘤微環(huán)境的平臺(tái)，用于研究腫瘤細(xì)胞與微環(huán)境之間的相互作用。
2. 藥物篩選：動(dòng)態(tài)仿生類器官培養(yǎng)系統(tǒng)可以用來進(jìn)行高通量的藥物篩選，通過集成的微流體通道和芯片模擬腫瘤與血管網(wǎng)絡(luò)的相互作用，評(píng)估藥物的輸送和腫瘤生長(zhǎng)。
3. 癌癥進(jìn)展研究：通過在動(dòng)態(tài)仿生類器官培養(yǎng)系統(tǒng)技術(shù)平臺(tái)上創(chuàng)建血管化腫瘤類器官模型，研究者可以觀察和分析腫瘤細(xì)胞的侵潤(rùn)、血管生成以及腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。
4. 個(gè)性化醫(yī)療：動(dòng)態(tài)仿生類器官培養(yǎng)系統(tǒng)可以用于個(gè)性化醫(yī)療研究，通過模擬特定患者的腫瘤微環(huán)境，測(cè)試患者特異性的癌癥治療方法。
5. 提高實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)化和可重復(fù)性：動(dòng)態(tài)仿生類器官培養(yǎng)系統(tǒng)有助于實(shí)現(xiàn)癌癥類器官培養(yǎng)的標(biāo)準(zhǔn)化，通過精確控制培養(yǎng)條件和環(huán)境參數(shù)，減少實(shí)驗(yàn)之間的變異性。
6. 三維培養(yǎng)和細(xì)胞間相互作用：動(dòng)態(tài)仿生類器官培養(yǎng)系統(tǒng)可以支持三維細(xì)胞培養(yǎng)，允許研究者研究腫瘤細(xì)胞與非腫瘤細(xì)胞（如成纖維細(xì)胞、免疫細(xì)胞）之間的相互作用。
7. 長(zhǎng)期培養(yǎng)和擴(kuò)增：微流控類器官芯片微生理系統(tǒng)提供了一種方法，用于長(zhǎng)期培養(yǎng)和擴(kuò)增癌癥類器官，同時(shí)保持其遺傳和表型特征。如小編正在科普的英國(guó)Kirkstall Quasi Vivo培養(yǎng)系統(tǒng)
8. 模擬腫瘤的動(dòng)態(tài)變化：通過該動(dòng)態(tài)仿生類器官培養(yǎng)技術(shù)，可以模擬腫瘤在治療過程中的動(dòng)態(tài)變化，包括對(duì)藥物的反應(yīng)和產(chǎn)生耐藥性。

 
9. 集成多個(gè)器官芯片：可以用于連接多個(gè)器官芯片（例如英國(guó)Kirkstall 智能自動(dòng)化類器官芯片培養(yǎng)微生理系統(tǒng)），模擬多個(gè)器官之間的相互作用和藥物的全身效應(yīng)。
（五）附《2025年度國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目指南》征訂通知