ELISA實(shí)驗(yàn)原理操作詳細(xì)介紹和Protocol解決方案及其應(yīng)用

圖 1. 常見的三種 ELISA 類型^[1]。 

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ELISA 的實(shí)驗(yàn)方案

ELISA 實(shí)驗(yàn)通常分為幾個步驟：包被、封閉、孵育、檢測和結(jié)果分析。 SO，接下來小 M 為大家?guī)�來�?shí)驗(yàn)必備的 Protocol! 

直接 ELISA

直接 ELISA 是檢測抗原的最簡單的方案。

將含有分析物的緩沖溶液加入 96 孔板中，讓其粘附在塑料板上一段時間 (圖 2a)。在直接 ELISA 中，加入帶有偶聯(lián)酶的一級檢測抗體，該抗體與覆蓋孔的抗原結(jié)合 (圖 2b)。將板孵育足夠長的時間以使抗原-抗體結(jié)合，并用磷酸鹽緩沖鹽水清洗以去除多余的抗體，然后加入酶的底物，在黑暗環(huán)境中等待酶-底物相互作用，然后用特定溶液停止反應(yīng)。酶-底物相互作用導(dǎo)致顏色形成，可通過微孔板讀數(shù)器檢測到 (圖 2c)。分析時，將樣品讀數(shù)與標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行比較。

圖 2. 直接 ELISA 方案^[3]。

 
基本操作：

一、包被：

(1) 包被抗原
向每孔加入 50–100 μL 預(yù)設(shè)濃度的抗原，封板后于 4 °C 孵育過夜。

(2) 洗滌
使用 ELISA 洗板機(jī)，用 0.05% PBST 緩沖液洗滌板三次。通過吸出或倒置板來填充和排空孔，以去除溶液。

二、封閉：

(3) 封閉
用含 3% BSA 的 PBS 緩沖液以 100–200 μL/孔的量封閉板，封板后于室溫孵育 1 小時。

(4) 洗滌
按照步驟（2）進(jìn)行洗滌。

三、孵育：

(5) 加入抗體偶聯(lián)物溶液
加入抗體偶聯(lián)物溶液 (Ab-HRP)，使用與步驟（1）相同體積的溶液體積，在含 0.5% BSA 的 0.05% PBST 緩沖液中進(jìn)行兩倍系列稀釋 (至少三個稀釋度)。每個稀釋度做三次重復(fù)。封板后于室溫孵育 1 小時。

(6) 洗滌
去除溶液，并使用 ELISA 洗板機(jī)，用 0.05% PBST 緩沖液洗滌板六次。

(7) 顯色
加入 TMB 底物溶液，使用與步驟（1）相同體積的溶液體積，于室溫孵育 7 分鐘或直至達(dá)到所需的顏色強(qiáng)度 (標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)出現(xiàn)明顯的梯度)。

(8) 終止反應(yīng)
向每孔加入 50 μL 2 M H₂SO₄ 溶液來終止反應(yīng)。

四、檢測分析：

(9) 讀板
使用具有適當(dāng)硬件的 ELISA 板讀數(shù)器測量吸光度。

(10) 數(shù)據(jù)分析

間接 ELISA

在間接 ELISA 中，抗原固定 (圖 3a )、封閉和洗滌后，加入與抗原結(jié)合的一抗 (圖 3b)。將載體在封閉緩沖液中孵育，使封閉緩沖液稀釋的一抗結(jié)合到載體上，并用洗滌緩沖液洗滌，然后加入封閉緩沖液和帶有酶標(biāo)的第二抗體 (圖 3c)。與直接 ELISA 類似，進(jìn)行再次孵育、洗滌，加入底物，并使用微孔板讀數(shù)器掃描孔 (圖 3d)。

第二抗體也可以用熒光素標(biāo)記，并使用熒光計在紫外光下對結(jié)果進(jìn)行量化。這種方法稱為熒光聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(Fluorescence-linked immunosorbent assay, FLISA)。

基本操作：

一、包被：

(1) 包被抗原
向每孔加入 50–100 μL 預(yù)設(shè)濃度的抗原，封板后于 4 °C 孵育過夜。

(2) 洗滌
使用 ELISA 洗板機(jī)，用 0.05% PBST 緩沖液洗滌板三次。通過吸出或倒置板來填充和排空孔，以去除溶液。

二、封閉：

(3) 封閉
用含 3% BSA 的 PBS 緩沖液以 100–200 μL/孔的量封閉板，封板后于室溫孵育 1 小時。

(4) 洗滌
按照步驟（2）進(jìn)行洗滌。

三、孵育：

(5) 加入一抗
加入一抗溶液，使用與步驟（1）相同體積的溶液體積，在含 0.5% BSA 的 0.05% PBST 緩沖液中進(jìn)行兩倍系列稀釋 (至少三個稀釋度)。每個稀釋度做三次重復(fù)。封板后于室溫孵育 1 小時。

(6) 洗滌
按照步驟（2）進(jìn)行洗滌。

(7) 加入二抗
加入二抗溶液，如 Goat Anti-Human IgG H&L (HRP)，稀釋于含 0.5% BSA 的 0.05% PBST 緩沖液中，使用與步驟（1）相同體積的溶液體積。封板后于室溫孵育 1 小時。

(8) 洗滌
去除溶液，并使用 ELISA 洗板機(jī)，用 0.05% PBST 緩沖液洗滌板六次。

(9) 顯色
加入 TMB 底物溶液，使用與步驟（1）相同體積的溶液體積，于室溫孵育 7 分鐘或直至達(dá)到所需的顏色強(qiáng)度 (標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)出現(xiàn)明顯的梯度)。

(10) 終止反應(yīng)
向每孔加入 50 μL 2 M H₂SO₄ 溶液來終止反應(yīng)。

四、檢測分析：

(11) 讀板
使用具有適當(dāng)硬件的 ELISA 板讀數(shù)器測量吸光度。

(12) 數(shù)據(jù)分析
 
應(yīng)用：

• 即時 HIV 檢測 (Point-of-care HIV testing)：測試棒上標(biāo)有 HIV 抗原，血液樣本放在測試棒的末端。緩沖液允許任何抗體沿著棒子流動，并附著在抗原上。用抗人抗體 (二抗) 清洗，用偶聯(lián)酶標(biāo)記，然后用染料清洗。顏色的變化代表積極的結(jié)果[3]。

 
夾心 ELISA

夾心ELISA 可分析更復(fù)雜的溶液。其名稱源于該裝置能夠?qū)⒖乖?ldquo;夾”在兩種抗體之間 (圖 4)。

將含有捕獲抗體的包被緩沖液加入孔板中并使其粘附 (圖 4a)。孵育后，清洗孔板并加入封閉緩沖液以封閉孔上任何剩余的結(jié)合位點(diǎn)。然后將樣品加入每個孔中并孵育特定時間 (圖 4b)。為確保結(jié)果的準(zhǔn)確性，必須對每個孔板運(yùn)行標(biāo)準(zhǔn)樣品 (陽性對照) 和空白樣品 (陰性對照)。然后將檢測抗體加入每個孔中 (圖 4c)，隨后加入偶聯(lián)的二抗和封閉緩沖液 (圖 4d)。在每個步驟之間，用磷酸鹽緩沖鹽水清洗孔。加入底物溶液并使用微孔板讀數(shù)器檢測結(jié)果 (圖 4e)。

基本操作：

一、包被：

(1) 包被捕獲抗體
向每孔加入 50–100 μL 預(yù)設(shè)濃度的捕獲抗體，封板后于 4 °C 孵育過夜或在室溫下孵育 2 小時。

(2) 洗滌
在 ELISA 洗板機(jī)中用 0.05% PBST 緩沖液洗滌三次。通過吸出或倒置板來填充和排空孔，以去除溶液。

二、封閉：

(3) 封閉
使用含 3% BSA 的 PBS 緩沖液（100–200 μL/孔）封閉板，封板后于室溫孵育 1 小時。

(4) 洗滌
按照步驟 (2) 進(jìn)行洗滌。

三、孵育：

(5) 加入標(biāo)準(zhǔn)品和樣品
向每孔加入 50–100 μL 標(biāo)準(zhǔn)品和樣品，使用與步驟（1）相同體積的溶液體積，在含 0.5% BSA 的 0.05% PBST 緩沖液中進(jìn)行兩倍系列稀釋 (至少三個稀釋度)。每個稀釋度做三次重復(fù)。封板后于室溫孵育 2 小時。

(6) 洗滌
去除溶液，并在 ELISA 洗板機(jī)中用 0.05% PBST 緩沖液洗滌六次。

(7) 加入一抗
加入另一種針對待測抗原不同表位的特異性檢測抗體，稀釋于含 0.5% BSA 的 0.05% PBST 緩沖液中，50–100 μL/孔，使用與步驟（1）相同體積的溶液體積。封板后于室溫孵育 1 小時。

(8) 加入二抗
加入二抗溶液，如 Goat Anti-Human IgG H&L (HRP)，稀釋于含 0.5% BSA 的 0.05% PBST 緩沖液中，50–100 μL/孔，使用與步驟（1）相同體積的溶液體積。封板后于室溫孵育 1 小時。

(9) 洗滌
去除溶液，并在 ELISA 洗板機(jī)中用 0.05% PBST 緩沖液洗滌六次。

(10) 顯色
加入 TMB 底物溶液，使用與步驟（1）相同體積的溶液體積，于室溫孵育 7 分鐘或直至達(dá)到所需的顏色強(qiáng)度 (標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)出現(xiàn)明顯的梯度)。

(11) 終止反應(yīng)
向每孔加入 50 μL 2 M H₂SO₄ 溶液來終止反應(yīng)。

四、檢測分析：

(12) 讀板
使用具有適當(dāng)硬件的 ELISA 板讀數(shù)器測量吸光度。

(13) 數(shù)據(jù)分析
分析數(shù)據(jù)。
 
應(yīng)用：

• 家用妊娠試劑盒 (Point-of-care pregnancy testing): 使用夾心 ELISA 法快速提供與患者相關(guān)的結(jié)果。試紙條含有抗 β 人絨毛膜促性腺激素 (抗 βhCG) 和結(jié)合抗體，這些抗體與尿液樣本中的 βhCG 發(fā)生反應(yīng)。用自來水沖洗試紙條以去除任何未結(jié)合的樣本，并與底物試劑一起孵育幾分鐘。顏色信號的存在和強(qiáng)度與樣本中的 βhCG 量成正比，可用于估計妊娠周齡。

 
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表 2. 實(shí)驗(yàn)失敗的可能性原因及解決方案^[3]。