單物鏡光片顯微鏡的技術(shù)原理及其在生物醫(yī)學(xué)的應(yīng)用

以傾斜平面照明和微鏡微器件反射技術(shù)為代表的單物鏡光片顯微技術(shù)突破上述限制，展示出在高分辨率和體積高速成像方面的優(yōu)勢(shì)，并且可與超分辨顯微術(shù)等多種技術(shù)結(jié)合，在近年來(lái)取得了巨大發(fā)展。

中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)的張一凡團(tuán)隊(duì)發(fā)表綜述文章《單物鏡光片三維熒光成像技術(shù)研究進(jìn)展（特邀）》，介紹了單物鏡光片顯微成像技術(shù)的原理、關(guān)鍵性能的提升和其在生物醫(yī)學(xué)的應(yīng)用。

光片顯微鏡概述
光學(xué)顯微鏡是生命科學(xué)研究的重要工具。20世紀(jì)80年代，共聚焦顯微鏡和雙光子顯微鏡出現(xiàn)，賦予了顯微鏡三維解析能力，但存在光毒性和光漂白問(wèn)題。

2004年，光片顯微鏡（LSM）出現(xiàn)，其激發(fā)光經(jīng)柱透鏡在樣品上形成光片，限制了照明范圍，減少了光損傷和光漂白。2008年，數(shù)字激光掃描顯微鏡（DLSM）是另一種形成光片的方法。

傳統(tǒng)光片顯微鏡由照明光路和探測(cè)光路組成，通常需要兩個(gè)正交的物鏡。但雙物鏡的使用帶來(lái)了一系列問(wèn)題，如樣品裝載手段復(fù)雜、不能使用常用載玻片、限制樣品種類(lèi)和安裝，需要物鏡有較長(zhǎng)工作距離，限制了高分辨率圖像的獲得，兩個(gè)光路間還需要精確對(duì)焦。

而以傾斜平面照明和微鏡微器件反射技術(shù)為代表的單物鏡光片顯微技術(shù)突破了上述限制，并展示出了在高分辨率和體積高速成像方面的優(yōu)勢(shì)。

單物鏡光片顯微鏡技術(shù)原理
傾斜平面照明顯微鏡（OPM）
2008年，Dunsby發(fā)明了傾斜光片照明顯微鏡。它把柱透鏡生成的片狀照明光引入原先探測(cè)物鏡的光路，同時(shí)在成像光路中設(shè)計(jì)了遠(yuǎn)程聚焦系統(tǒng)，引入二級(jí)和三級(jí)物鏡來(lái)復(fù)制和成像樣本的三維信息。

三維成像掃描方式

• 移動(dòng)載物臺(tái)掃描：這是一種常見(jiàn)的方法，通過(guò)移動(dòng)載物臺(tái)使光片掃過(guò)樣品各部分。但它有很多缺點(diǎn)，比如受樣品體積限制，運(yùn)動(dòng)不穩(wěn)定會(huì)耗時(shí)，還會(huì)引入運(yùn)動(dòng)偽影影響圖像質(zhì)量。后來(lái)Kumar等進(jìn)行了改進(jìn)，把物鏡壓電移動(dòng)平臺(tái)安裝在二級(jí)物鏡處，通過(guò)移動(dòng)二級(jí)物鏡來(lái)改變光片位置實(shí)現(xiàn)三維掃描，提高了成像速度。

• 利用檢流計(jì)振鏡掃描：這種方法可以使照明光片快速掃過(guò)樣本。例如Bouchard等開(kāi)發(fā)的平面掃面共焦（SCAPE）顯微鏡，利用定制六邊形振鏡大大提高了三維成像速度。之后還有很多改進(jìn)的掃描方式，像SOPI-OPM、SCAPE 2.0等，它們?cè)谔岣咚俣鹊耐瑫r(shí)也不斷優(yōu)化成像效果。

多視圖光片成像
在實(shí)際成像過(guò)程中，光片穿過(guò)樣品會(huì)因?yàn)樯⑸�、吸收等�?wèn)題導(dǎo)致光衰減，尤其是在腦組織等復(fù)雜生物樣品中，散射會(huì)讓圖像質(zhì)量下降很快。多視圖光片顯微鏡就可以解決這個(gè)問(wèn)題，它利用兩個(gè)或多個(gè)不同方向的光片照明，獲得多個(gè)視角的圖像，再通過(guò)圖像融合算法把這些圖像組合起來(lái)，減少散射引起的偽影，得到各向同性分辨率的圖像。

基于微鏡反射的單物鏡光片顯微鏡
針尖微懸臂反射鏡
2013年，Gebhardt等開(kāi)發(fā)了利用原子力顯微鏡（AFM）臂的反射型光片顯微鏡，斜入射的光片在壁上反射照明樣品。2018 年，Ponjavic等利用原子力顯微鏡的單臂也開(kāi)發(fā)了一種單物鏡光片顯微鏡。

微流控制備微反射鏡器件
2015年，Galland等設(shè)計(jì)了一款特別的單物鏡光片顯微鏡。它不需要遠(yuǎn)程聚焦系統(tǒng)，光片方向垂直于物鏡光軸。它使用定制的樣品裝載容器，把45°反射微鏡放在硅片的微孔里。照明光束從物鏡后焦面斜入射，經(jīng)反射后形成垂直光軸的照明光片。這個(gè)顯微鏡還可以和倒置商用標(biāo)準(zhǔn)顯微鏡兼容，能使用多種物鏡，生成不同厚度的光片，滿足多種尺度的研究需求。

單物鏡光片顯微鏡關(guān)鍵性能提升
空間分辨率
OPM雖然解決了正交光片顯微鏡不能使用高數(shù)值孔徑物鏡的問(wèn)題，但實(shí)際使用中，物鏡的高數(shù)值孔徑并不能完全被利用。這是因?yàn)檎彰鞴馐鴷?huì)分占一部分?jǐn)?shù)值孔徑，而且遠(yuǎn)程聚焦系統(tǒng)中第二物鏡與第三物鏡傾斜放置，導(dǎo)致光不能完全中繼到第三物鏡上。

單物鏡光片顯微鏡在生物醫(yī)學(xué)的應(yīng)用
傾斜平面照明顯微鏡的生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用
光片顯微鏡因?yàn)楣舛拘缘�，常被用于活體胚胎等大樣本的長(zhǎng)時(shí)間發(fā)育成像。單物鏡光片顯微鏡更是把振鏡掃描方式引入光片顯微鏡的三維成像，極大地提高了體積成像速度。