應(yīng)用案例：對牙膏中的耐熱大腸菌群進行檢驗

方案摘要：耐熱大腸菌群系一群需氧及兼性厭氧革蘭氏陰性無芽胞桿菌，在44.5℃培養(yǎng)24 h～48 h能發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸并產(chǎn)氣。該菌主要來自人和溫血動物糞便，可作為糞便污染指標(biāo)來評價牙膏的衛(wèi)生質(zhì)量, 推斷牙膏中有否污染腸道致病菌的可能。本方法利用fluidot移液類產(chǎn)品達到快速檢測出牙膏中耐熱大腸菌群含量。
 
方案詳情：

• 實驗原理

使用特定的培養(yǎng)基和試劑用于支持耐熱大腸菌群的生長‌，通過培養(yǎng)基的培養(yǎng)和適當(dāng)?shù)臏囟葪l件下（通常是35-37℃）的孵育，觀察是否有耐熱大腸菌群生長‌。
二、實驗準(zhǔn)備
1、 儀器
①  恒溫水浴箱或隔水式恒溫箱：44.5℃±0.5℃。
②  溫度計。
③  顯微鏡。
④  載玻片。
⑤  接種環(huán)fluidot  FDT-D80001
⑥ 電磁爐。
⑦  三角瓶：250 mL。
⑧  試管：18 mm×150 mm。
⑨  小倒管。
⑩  pH計或pH試紙。
⑪  高壓滅菌器。
⑫ 無菌吸管：1 mL（具0.01 mL刻度）FDT-SP01001
⑬無菌吸管：10 mL（具0.1 mL刻度）FDT-SP01010
⑭手動移液器：fluidot  1 mL  MSP1K與 10 mL  MSP10K
⑮電動移液器：pipetty  1 mL  MSIC01-02-1000
⑯吸頭：1.5mL   FDT-1500-1-TSF
⑰滅菌平皿：fluidot  FDT-9CM-2-S，直徑90 mm。
⑱蠕動泵分液器：fluidot  600D
 
2、培養(yǎng)基和試劑
①  SCDLP液體培養(yǎng)基
②  雙倍乳糖膽鹽（含中和劑）培養(yǎng)基   
③  伊紅美藍(lán)（EMB）瓊脂   
④  蛋白胨水（靛基質(zhì)試驗用）
⑤  靛基質(zhì)試劑
⑥  革蘭氏染色液：  
三、實驗步驟
 
①  取10 mL 1:10的檢液，加到10 mL雙倍乳糖膽鹽（含中和劑）培養(yǎng)基中，置44.5℃±0.5℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h±2 h，如既不產(chǎn)酸也不產(chǎn)氣，繼續(xù)培養(yǎng)至48 h±2 h，如仍既不產(chǎn)酸也不產(chǎn)氣，則報告為耐熱大腸菌群陰性。
②  如產(chǎn)酸產(chǎn)氣，劃線接種到伊紅美藍(lán)瓊脂平板上，置36℃±1℃培養(yǎng)18 h~24 h。同時取該培養(yǎng)液1~2滴接種到蛋白胨水中，置44.5℃±0.5℃培養(yǎng)24 h±2 h。 經(jīng)培養(yǎng)后，在上述平板上觀察有無典型菌落生長。耐熱大腸菌群在伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基上的典型菌落呈深紫黑色，圓形，邊緣整齊，表面光滑濕潤，常具有金屬光澤。也有的呈紫黑色，不帶或略帶金屬光澤；或粉紫色、中心較深的菌落，亦常為耐熱大腸菌群，應(yīng)注意挑選。
③  挑取上述可疑菌落，涂片作革蘭氏染色鏡檢。
④  在蛋白胨水培養(yǎng)液中，加入靛基質(zhì)試劑約0.5 mL，觀察靛基質(zhì)反應(yīng)。陽性反應(yīng)液面呈玫瑰紅色；陰性反應(yīng)液面呈試劑本色。
⑤  如選擇生化鑒定試劑盒或微生物鑒定系統(tǒng)，可從營養(yǎng)瓊脂平板上挑取經(jīng)純化的可疑菌落，用無菌稀釋液制備成濁度適當(dāng)?shù)木鷳乙�，使用生化鑒定試劑盒或微生物鑒定系統(tǒng)進行鑒定。
四、檢驗結(jié)果報告
經(jīng)上述檢驗步驟，若發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，平板上有典型菌落，并經(jīng)證實為革蘭氏陰性無芽胞短桿菌，靛基質(zhì)試驗陽性，則可報告被檢樣品中檢出耐熱大腸菌群。