線粒體蛋白Sirtuin5去琥珀酰化調節(jié)線粒體穩(wěn)態(tài)介導壓縮誘導椎間盤退變

椎間盤退變（IDD）已被廣泛認為是腰痛的主要病理原因。椎間盤（IVD）由中央凝膠狀髓核（NP）、周圍纖維環(huán)（AF）和軟骨終板（CEP）組成，起到脊柱減震器的作用，以承受機械沖擊。研究表明，由持續(xù)或過度機械負荷誘導的細胞外基質（ECM）降解和 NP 組織內(nèi)細胞凋亡在 IDD 的發(fā)病機制中起關鍵作用。

線粒體作為一種高度動態(tài)的細胞器，不斷進行融合和分裂形成動態(tài)平衡使細胞適應和響應不斷變化的微環(huán)境。NP 組織中的細胞被認為含有一些功能性線粒體，其功能障礙已被證實是導致 IDD 的主要原因。因此，需要進一步研究 IDD 發(fā)展過程中過度機械負荷與 NP 細胞內(nèi)線粒體損傷之間的潛在聯(lián)系。

琥珀酰化是最近發(fā)現(xiàn)的蛋白質翻譯后修飾，涉及可逆的蛋白質修飾過程，通常發(fā)生在賴氨酸殘基上，琥珀酰輔酶A（succinyl-CoA）是賴氨酸琥珀�；�的輔因子。由于琥珀酰輔酶A 是在線粒體中產(chǎn)生的，因此琥珀�；�是調節(jié)線粒體內(nèi)關鍵代謝過程的基本生物學過程。越來越多的證據(jù)表明，靶向線粒體蛋白Sirtuin5（SIRT5）的方法完全能夠影響蛋白質的琥珀�；�，并可以通過維持線粒體穩(wěn)態(tài)來有效抑制與年齡相關的退行性疾病的發(fā)生和發(fā)展。

鑒于此，空軍軍醫(yī)大學西京醫(yī)院骨科研究所、菏澤市立醫(yī)院重癥監(jiān)護科及西北工業(yè)大學醫(yī)學研究院的科研團隊在一項研究中綜合分析了過度機械負荷對蛋白質表達的影響，證明了SIRT5在壓縮誘導的IDD中發(fā)揮保護作用，并進一步揭示了SIRT5表達的抑制導致AIFM1的琥珀�；�增加，進而消除了AIFM1與CHCHD4之間的相互作用，導致線粒體功能障礙，最終導致過度機械負荷下IDD的發(fā)展。其研究成果在線發(fā)表于國際期刊 Experimental & Molecular Medicine 題為“SIRT5-related desuccinylation modification of AIFM1 protects against compression-induced intervertebral disc degeneration by regulating mitochondrial homeostasis”。

首先，為探究機械應力誘導NP變性的具體機制，建立了大鼠尾部加壓模型。GO分析表明，線粒體在機械負荷誘導的NP組織變性中起著重要作用，壓縮可能影響線粒體中蛋白質的定位。此外，加壓組中一些編碼線粒體蛋白的基因，如 Mapk2k、Sirt5、Oxc1的表達水平顯著降低。為了進一步驗證蛋白質組學結果，將大鼠NP細胞在靜態(tài)壓縮 1.0 MPa 的壓縮培養(yǎng)室中培養(yǎng) 0 或 24 小時，定量分析表明，與未加載的細胞相比，壓縮的 NP 細胞內(nèi)線粒體腫脹和碎片化明顯。此外，用1.0 MPa壓縮處理的NP細胞的轉錄組學數(shù)據(jù)顯示，差異表達基因集中在線粒體自噬上，進一步證實了機械應力下的線粒體損傷以及線粒體參與壓縮誘導的 IDD。

Sirt5是線粒體中重要的去琥珀�；�修飾酶，也是壓縮下變化最顯著的基因。進一步的蛋白質印跡試驗表明，1.0 MPa壓縮也以時間依賴性方式顯著抑制NP細胞中SIRT5的表達。通過收集不同Pfirrmann等級MRI圖像的患者樣本進一步確認IDD與SIRT5表達之間的關系，發(fā)現(xiàn)SIRT5表達與IDD嚴重程度呈負相關。這些結果表明，過度機械負荷會損害 NP 組織內(nèi)的線粒體，并導致線粒體蛋白 SIRT5 的表達降低，說明 SIRT5 可能在壓縮誘導的 IDD 中發(fā)揮重要作用。

然后，研究人員假設 SIRT5 在壓縮誘導的椎間盤退變中起保護作用，并在 NP 細胞中敲低或過表達Sirt5（圖1 a）。不出所料，與未處理組相比，si-Sirt5組的蛋白質琥珀�；�水平明顯較高，lenti-Sirt5組的蛋白質琥珀�；�水平顯著較低（圖1 a），這進一步證實了SIRT5在NP細胞中有效的去琥珀酰酶活性。

此外，Annexin-V/PI（圖1 b）和TUNEL染色（圖1 c、d）實驗表明，Sirt5過表達顯著減弱了壓縮誘導的NP細胞凋亡，而敲低Sirt5則加劇了過度機械負荷誘導的細胞凋亡。免疫熒光染色（圖1 c）和蛋白質印跡（圖1 e、f）結果表明，與僅接受機械應力處理的NP細胞相比，Sirt5過表達部分抑制了機械應力誘導的分解代謝狀態(tài)，包括聚集蛋白聚糖表達的增加和MMP13表達的降低。相比之下，敲低 Sirt5 加劇了壓縮誘導的分解代謝狀態(tài)。這些結果證明，SIRT5的表達在保護NP細胞免受機械應力方面起著至關重要的作用，而SIRT5對于維持體外NP穩(wěn)態(tài)至關重要。

圖1 SIRT5保護NP細胞免受壓縮誘導的凋亡和功能障礙。

為了進一步驗證SIRT5對機械應力下NP組織的保護作用，對WT小鼠或Sirt5 KO小鼠（WT sham組；KO sham組；WT LSI組；KO LSI組）進行了腰椎不穩(wěn)（LSI）或假手術，評估椎間盤退變的程度（圖2 a、c）。與WT+LSI組相比，KO+LSI組的IVDs，尤其是IVDs的L2-3和L3-4段的T2信號強度明顯降低，而WT假手術組和KO假手術組的T2信號強度沒有差異（圖2 b），表明在持續(xù)的機械應力下，Sirt5缺失小鼠的NP組織中的ECM降解更快。

此外，與WT小鼠相比，Sirt5-null小鼠的椎間盤高度指數(shù)（DHI）下降得更嚴重（圖2 d），表明在持續(xù)的機械負荷下，Sirt5缺失小鼠的椎間盤結構受到更嚴重的損傷。與此一致，組織學和免疫熒光染色分析也顯示，Sirt5-null小鼠的NP組織退行性變化更嚴重（圖2 e）。這些發(fā)現(xiàn)表明，Sirt5 KO小鼠以加速模式進展為LSI誘導的IDD，這進一步證實了SIRT5在NP組織中對抗過度機械負荷的重要作用�？紤]到受壓下NP細胞中線粒體損傷和SIRT5的表達減少，研究推測SIRT5通過維持線粒體穩(wěn)態(tài)起到保護作用。

因此，監(jiān)測了用 si-Sirt5 或陰性對照（si-NC）處理的 NP 細胞的線粒體形態(tài)、組成和能量代謝，發(fā)現(xiàn)在Si-NC處理下，NP細胞內(nèi)絕大多數(shù)線粒體呈現(xiàn)完整結構，而用si-Sirt5處理的細胞則表現(xiàn)出線粒體腫脹和碎片化。此外，si-Sirt5處理的NP細胞表現(xiàn)出明顯的代謝減弱，電子轉移鏈（ETC）復合物蛋白顯著減少。這些結果表明，SIRT5在調節(jié)NP細胞的線粒體形態(tài)、組成和能量代謝方面起著重要作用，其敲低導致線粒體穩(wěn)態(tài)受損。

圖2 Sirt5 KO小鼠在LSI手術后表現(xiàn)出更嚴重的 IVDs退行性表型。

進一步地，為探究SIRT5參與線粒體穩(wěn)態(tài)調控的具體分子機制，實驗通過Co-IP獲得NP細胞的SIRT5結合蛋白，并通過質譜（MS）和數(shù)據(jù)庫生物信息學分析鑒定了其結合靶點——凋亡誘導因子線粒體相關1（AIFM1）。AIFM1 通過固定線粒體內(nèi)膜中的 CHCHD4，確保 CHCHD4 在氧化和穩(wěn)定線粒體輸入小分子中的作用。蛋白質印跡和免疫染色結果顯示，SIRT5的Co-IP產(chǎn)物中檢出AIFM1，AIFM1的反向Co-IP產(chǎn)物中也檢出SIRT5，且SIRT5 和 AIFM1 在 NP 細胞中具有很強的共定位性，確認了兩個分子之間的直接相互作用。

研究人員假設 SIRT5 通過去琥珀�；�調節(jié) AIFM1 的翻譯后修飾。琥珀�；�試驗結果表明，通過添加琥珀酰輔酶A，NP細胞中琥珀�；�的AIFM1以劑量依賴性方式增加。此外，敲低Sirt5顯著增加了NP細胞中AIFM1的琥珀�；�，但敲低Sirt5對NP細胞中AIFM1和CHCHD4的表達無顯著影響，而與AIFM1結合的CHCHD4總量顯著減少。

體外琥珀�；瘻y定發(fā)現(xiàn)，加入琥珀酰輔酶A后AIFM1的琥珀�；�增加，與AIFM1結合的CHCHD4減少。此外，在用si-Sirt5處理的NP細胞的線粒體中，CHCHD4（而非AIFM1）的豐度顯著降低，進一步證實 Sirt5 的敲低會損害 AIFM1-CHCHD4 復合物的活性。這些結果表明，由于其去琥珀�；�酶活性，SIRT5表達降低增強了AIFM1的琥珀�；�，這反過來消除了AIFM1和CHCHD4之間的相互作用，從而損害了AIFM1-CHCHD4復合物的運輸功能。

為了驗證 SIRT5 和 AIFM1-CHCHD4 復合物在機械應力下線粒體功能障礙和 NP 細胞變性中的作用，分別敲低 NP 細胞中的 Aifm1 和 Chchd4。蛋白質印跡測定（圖3 a）表明，機械應力下ETC復合蛋白的表達顯著降低。Sirt5的過表達部分恢復了ETC復合蛋白的降低。然而，敲低Aifm1或Chchd4消除了SIRT5在機械應力下的挽救作用（圖3 a-f）。此外，NP細胞中線粒體形態(tài)在機械應力下受到破壞（圖3 h），Sirt5的過表達部分抑制了線粒體的形態(tài)損傷，而敲低Aifm1或Chchd4則消除了這種作用。同樣，敲除Aifm1或Chchd4也消除了SIRT5在機械應力下對ATP合成的拯救作用（圖3 g）。

檢測 SIRT5 和 AIFM1-CHCHD4 復合物在機械應力下維持 NP 細胞活力的作用（圖3 i），同樣發(fā)現(xiàn)Sirt5過表達抑制了壓縮誘導的NP細胞凋亡，而敲低Aifm1或Chchd4則逆轉了這種保護作用（圖3 i、j）。此外，Sirt5過表達顯著抑制了ECM在壓縮下的降解，而敲低AIFM1或CHCHD4也消除了SIRT5的這種保護作用（圖3 k-p）。這些結果進一步證實，過度的機械負荷通過 SIRT5-AIFM1-CHCHD4 通路導致線粒體功能障礙和 NP 細胞變性。

圖3 敲低Aifm1或Chchd4顯著逆轉了Sirt5過表達對壓縮下NP細胞的保護作用。

最后，為了確定上述發(fā)現(xiàn)是否具有潛在的轉化意義，進行大鼠尾部壓縮或假手術，然后在椎間盤內(nèi)過表達Sirt5 或腹膜內(nèi)注射亞甲藍（MB，一種可替代的線粒體電子轉移載體，可恢復由 AIF 缺乏引起的線粒體功能障礙）。結果表明，過表達Sirt5或MB處理部分恢復了靜態(tài)壓縮誘導的Pfirrmann等級升高，以及逆轉壓縮導致的椎間盤高度降低，并成功改善了機械應力誘導的組織學損傷。此外，機械應力作用下NP組織中TUNEL陽性細胞和MMP13表達增加，SIRT5、Aggrecan和CHCHD4表達減少，但Lenti-Sirt5和MB處理均能部分逆轉機械應力誘導的表型變化。這些研究結果進一步證明了SIRT5-AIFM1-CHCHD4通路在調節(jié)IVD穩(wěn)態(tài)中的作用，并證實了Sirt5過表達或MB給藥對體內(nèi)IDD過程的治療作用。

圖4 NP細胞內(nèi)壓縮誘導的線粒體功能障礙機制的示意圖。

過高的機械負荷通過降低去琥珀酰酶 SIRT5 的表達來增加 NP 細胞內(nèi) AIFM1 的琥珀�；�，進而消除 AIFM1 和 CHCHD4 之間的相互作用，導致 CHCHD4 依賴性線粒體膜間空間成分輸入的破壞，從而減少線粒體 ETC 復合物亞基。減少的ETC復合物亞基最終導致線粒體功能障礙，并在過度機械負荷下促進IDD的發(fā)展。

綜上所述，該研究揭示了機械應力誘導的椎間盤退化的新分子機制。研究結果首次證明，過度的機械負荷通過降低去琥珀酰化酶SIRT5的表達來增加NP細胞中的琥珀�；�水平，損害線粒體功能并導致隨后的IDD發(fā)生，并通過上調 Sirt5 表達或 MB 給藥，評估了兩種不同治療方法在壓力誘導的大鼠椎間盤退變模型中靶向破壞線粒體蛋白輸入治療的有效性。這項研究為IDD的發(fā)生和發(fā)展提供了新的見解，并為IDD提供了有希望的治療方法。

參考文獻：Mao J, Wang D, Wang D, Wu Q, Shang Q, Gao C, Wang H, Wang H, Du M, Peng P, Jia H, Xu X, Wang J, Yang L, Luo Z. SIRT5-related desuccinylation modification of AIFM1 protects against compression-induced intervertebral disc degeneration by regulating mitochondrial homeostasis. Exp Mol Med. 2023 Jan;55(1):253-268. doi: 10.1038/s12276-023-00928-y. Epub 2023 Jan 18. PMID: 36653443; PMCID: PMC9898264.

原文鏈接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/36653443/

Journal Impact Factor: 9.5

ISSN 2092-6413 (online) ISSN 1226-3613 (print)

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