電壓門控性鈣通道α2δ亞基-1調(diào)控結(jié)腸癌進(jìn)展并影響其微環(huán)境

CACNA2D1 regulates the progression and influences the microenvironment of colon cancer

Keywords: CACNA2D1; Colon cancer; Fibroblast; Voltage-gated calcium channel; p53.

近年來，由于化療的進(jìn)步和分子靶向藥物的出現(xiàn)，結(jié)腸癌（CC）的治療結(jié)果有所改善。離子轉(zhuǎn)運體（Ion transporters）在細(xì)胞功能中起著至關(guān)重要的作用，近年來作為癌癥的潛在治療靶點而受到關(guān)注。闡明基因和蛋白質(zhì)在癌癥微環(huán)境中的功能是引起廣泛關(guān)注的研究領(lǐng)域，因此，腫瘤與基質(zhì)之間的關(guān)系以及腫瘤細(xì)胞與成纖維細(xì)胞之間的相互作用在癌癥調(diào)控中的重要作用值得深入探討。

電壓門控鈣離子通道（Voltage-gated Calcium Channels，VGCCs）是由 4-5 個亞基組成的復(fù)合蛋白。電壓門控性鈣通道α2/δ亞基-1（CACNA2D1）編碼 alpha2/delta 亞基家族的成員，是電壓依賴性鈣通道復(fù)合體中的一種蛋白質(zhì)，已被報道為幾種癌癥的致癌基因。然而，其在 CC 中的功能尚不清楚，且與癌癥微環(huán)境之間的關(guān)系也尚未見報道。

鑒于此，日本京都府立醫(yī)科大學(xué)消化外科的課題組在最近的研究中探討了鈣通道對癌癥的作用，闡釋了 CACNA2D1 在調(diào)控 CC 患者腫瘤進(jìn)展中的作用及其臨床病理意義，還討論了 CACNA2D1 表達(dá)與基質(zhì)之間的關(guān)系及其對癌癥微環(huán)境的影響。研究表明，CACNA2D1 在腫瘤進(jìn)展中起著至關(guān)重要的作用，并影響結(jié)腸癌患者的微環(huán)境。研究成果發(fā)表在 Journal of Gastroenterology 期刊題為“CACNA2D1 regulates the progression and influences the microenvironment of colon cancer”。

IHC 分析顯示，癌變區(qū)域的染色強(qiáng)度根據(jù)CACNA2D1表達(dá)水平而變化。CACNA2D1 高表達(dá)與高度分化程度的腫瘤相關(guān)。高CACNA2D1表達(dá)組的 5 年無復(fù)發(fā)生存率和5 年總生存率（OS）顯著低于CACNA2D1低表達(dá)組，證實了CACNA2D1高表達(dá)組的 CC 患者預(yù)后較差。

利用 RT-PCR 和 Western Blotting 分別檢測8 株 CC 細(xì)胞系中 CACNA2D1 的基因和蛋白表達(dá)。結(jié)果表明，每個 CC 細(xì)胞系均表達(dá) CACNA2D1，并選擇CACNA2D1高表達(dá)的HCT116、RKO和SW480細(xì)胞進(jìn)行隨后實驗。

轉(zhuǎn)染CACNA2D1 siRNA后48或72 h，HCT116、RKO和SW480細(xì)胞的數(shù)量顯著低于轉(zhuǎn)染對照siRNA的細(xì)胞（圖1 a）。增殖測定結(jié)果顯示，CACNA2D1 缺失的 HCT116、RKO 和 SW480 細(xì)胞的吸光度顯著低于對照細(xì)胞（圖1 b）。細(xì)胞周期分析顯示，與對照細(xì)胞相比，CACNA2D1 缺失的 HCT116 和 RKO 細(xì)胞中處于 sub-G1 期的細(xì)胞數(shù)量增加（圖1 c）。這些結(jié)果表明，CACNA2D1 調(diào)節(jié) CC 細(xì)胞的增殖和細(xì)胞周期。

siRNA 轉(zhuǎn)染后 72 h，CACNA2D1缺失的 HCT116、RKO 和 SW480 細(xì)胞中早期（膜聯(lián)蛋白V-陽性和 PI-陰性）和晚期凋亡細(xì)胞（膜聯(lián)蛋白V-陽性和 PI-陽性）的比例顯著高于用對照細(xì)胞（圖1 d）。這表明，CACNA2D1 會調(diào)控 CC 細(xì)胞的凋亡。傷口愈合試驗分析顯示，與對照細(xì)胞相比，CACNA2D1 缺失的 HCT116 和 RKO 細(xì)胞的遷移受到顯著抑制（圖1 e），這說明，CACNA2D1 也調(diào)控 CC 細(xì)胞的遷移。

此外，還分析了 CACNA2D1 特異性抑制劑氨氯地平（amlodipine）對 HCT116 和 RKO 細(xì)胞的抑制和細(xì)胞毒性作用，結(jié)果在兩種細(xì)胞系中均觀察到細(xì)胞毒性，且氨氯地平處理的 HCT116 和 RKO 細(xì)胞的早期和晚期細(xì)胞凋亡增加。

圖1 CACNA2D1調(diào)節(jié)結(jié)腸癌（CC）細(xì)胞的增殖、細(xì)胞周期、凋亡和遷移。

接下來，進(jìn)行了共培養(yǎng)實驗（圖2 a）分析 CACNA2D1 對 CC 細(xì)胞系中成纖維細(xì)胞遷移的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與陰性對照 HCT116 和 RKO 細(xì)胞相比，CACNA2D1缺失的 HCT116 和 RKO 細(xì)胞的成纖維細(xì)胞遷移受到顯著抑制（圖2 c）。這提示，CC 中的 CACNA2D1 可能調(diào)控成纖維細(xì)胞遷移并影響微環(huán)境。

敲低CACNA2D1后發(fā)現(xiàn)，與陰性對照 HCT116 細(xì)胞培養(yǎng)基中釋放的轉(zhuǎn)化生子因子（TGFB1）和血小板源性生長因子（PDGF-BB）相比，CACNA2D1缺失的 HCT116 培養(yǎng)基的釋放水平降低（圖2 d）。這說明，CACNA2D1調(diào)控 CC 細(xì)胞分泌的 TGFB1 和 PDGF-BB水平。

進(jìn)一步利用共培養(yǎng)系統(tǒng)（圖2 b）研究 CACNA2D1 敲低是否會改變 CC 細(xì)胞系中的成纖維細(xì)胞增殖，發(fā)現(xiàn) CACNA2D1 敲低并不影響 CC 細(xì)胞中的成纖維細(xì)胞增殖。

當(dāng) CC 細(xì)胞系與成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)時，成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞（CAF），CAF 標(biāo)志物水平升高。然而，HCT116 和 RKO 細(xì)胞中的 CACNA2D1 敲低在共培養(yǎng)時可下調(diào)其標(biāo)志物的表達(dá)，抑制了成纖維細(xì)胞向 CAF 的轉(zhuǎn)化（圖2 e）。

圖2 CACNA2D1對成纖維細(xì)胞與癌細(xì)胞共培養(yǎng)的影響。

最后，利用微陣列分析闡明 CACNA2D1 缺失的 HCT116 細(xì)胞的基因表達(dá)譜。結(jié)果顯示，2847 個基因上調(diào)，2832 個基因下調(diào)。生信分析IPA數(shù)據(jù)庫將“cancer”和“organismal injury and abnormalities”確定為排名靠前的兩種疾病，而排名靠前的兩種分子和細(xì)胞功能是“cellular assembly and organization”和“cellular function and maintenance”。

IPA 確定 p53 信號通路是受 CACNA2D1 敲低影響的排名靠前的經(jīng)典通路之一。此外，實驗還驗證了四個已知基因（TP53、FAS、caspase 6 和 BAX，圖3 a）的表達(dá)水平。在CACNA2D1缺失的 HCT116 和 RKO 細(xì)胞中TP53、FAS、caspase 6 和 BAX 的 mRNA 表達(dá)顯著高于陰性對照細(xì)胞（圖3 c）。相反，與 EMT 相關(guān)通路相關(guān)的基因的表達(dá)下降（圖3 b）。在CACNA2D1缺失的 HCT116 和 RKO 細(xì)胞中CDH1 的 mRNA 表達(dá)顯著上調(diào)，而 CDH2、ZEB1、ZEB2、TGFB1、TGFBR1 和 VIM 的 mRNA 表達(dá)顯著下調(diào)（圖3 d）。此外，cBioPortal 數(shù)據(jù)庫也揭示了CACNA2D1 與這些基因之間的密切相關(guān)性。這些數(shù)據(jù)表明，CACNA2D1調(diào)控 p53 信號通路和上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）相關(guān)通路。

圖3 網(wǎng)絡(luò)分析使用微陣列分析和IPA通路分析。紅色表示基因上調(diào)，綠色表示基因下調(diào)，橙色表示預(yù)期會上調(diào)的基因，藍(lán)色表示預(yù)期會下調(diào)的基因。

綜上所述，該研究顯示，CACNA2D1 高表達(dá)水平與 CC 患者預(yù)后不良相關(guān)，并且基質(zhì)表達(dá)水平也高。CACNA2D1 還可調(diào)控 CC 細(xì)胞的增殖、凋亡和遷移。此外，CACNA2D1 影響成纖維細(xì)胞的遷移并促進(jìn)成纖維細(xì)胞向 CAFs 的轉(zhuǎn)化。微陣列分析顯示，CACNA2D1 改變了細(xì)胞凋亡相關(guān)和 EMT 相關(guān)基因的表達(dá)。目前的結(jié)果揭示了 CACNA2D1 在 CC 中的功能，表明其有潛力作為CC腫瘤生長的生物標(biāo)志物和有希望的CC治療靶點。

參考文獻(xiàn)：Inoue H, Shiozaki A, Kosuga T, Shimizu H, Kudou M, Arita T, Konishi H, Komatsu S, Kuriu Y, Kubota T, Fujiwara H, Morinaga Y, Konishi E, Otsuji E. CACNA2D1 regulates the progression and influences the microenvironment of colon cancer. J Gastroenterol. 2024 Jul;59(7):556-571. doi: 10.1007/s00535-024-02095-x. Epub 2024 Mar 27. PMID: 38536483.

原文鏈接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38536483/

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