類器官技術(shù)與合成生物學(xué)協(xié)同研究進(jìn)展及兩者未來結(jié)合應(yīng)用的潛力分析

原創(chuàng) ：子苓，向陽飛文章來源： 合成生物學(xué)期刊

引用本文: 陳子苓, 向陽飛. 類器官技術(shù)與合成生物學(xué)協(xié)同研究進(jìn)展[J]. 合成生物學(xué), 2024, 5(4): 795-812

Citation: CHEN Ziling, XIANG Yangfei. Integrated development of organoid technology and synthetic biology[J]. Synthetic Biology Journal, 2024, 5(4): 795-812

DOI: 10.12211/2096-8280.2023-106

摘 要

類器官由成體干細(xì)胞或多能干細(xì)胞在體外分化而來，可以在細(xì)胞類型、空間結(jié)構(gòu)及生理功能上實(shí)現(xiàn)對體內(nèi)組織器官的模擬。類器官的構(gòu)建及技術(shù)完善，推動了發(fā)育生物學(xué)、遺傳學(xué)、病理毒理學(xué)等發(fā)展。合成生物學(xué)是一門多學(xué)科交叉的新興學(xué)科，以工程學(xué)思想為指導(dǎo)，旨在通過工程化、模塊化的方法設(shè)計(jì)、改造、構(gòu)建生物元件、系統(tǒng)、功能等。近年來類器官構(gòu)建的優(yōu)化方案體現(xiàn)了與合成生物學(xué)契合的研究理念，而合成生物學(xué)的發(fā)展及相關(guān)方法的產(chǎn)生也為類器官技術(shù)的發(fā)展起到了推動作用。本文將概述類器官和合成生物學(xué)的發(fā)展歷程與面對的挑戰(zhàn)，探討類器官優(yōu)化過程中合成生物學(xué)策略的體現(xiàn)與新興的合成生物學(xué)工具對于類器官在時(shí)空命運(yùn)調(diào)控、結(jié)構(gòu)自組織及功能形成等方面的優(yōu)化作用，簡述基于類器官模型的研究對于合成生物學(xué)發(fā)展的促進(jìn)作用�？偟膩碚f，本文旨在闡述合成生物學(xué)與類器官構(gòu)建及優(yōu)化之間相輔相成、互相促進(jìn)的關(guān)系，并進(jìn)一步探討合成生物學(xué)與類器官在未來結(jié)合應(yīng)用的潛力。

全 文

類器官（organoid）作為近年來生命科學(xué)研究的重要技術(shù)突破之一，在實(shí)現(xiàn)多能干細(xì)胞（pluripotent stem cell，PSC）或成體干細(xì)胞（adult stem cell，ASC）在體外分化出具有特定功能的細(xì)胞類型的同時(shí)，也能夠建立三維（three-dimensional，3D）空間組織，從而重現(xiàn)體內(nèi)器官的結(jié)構(gòu)與功能。類器官彌補(bǔ)了二維（two-dimensional，2D）細(xì)胞培養(yǎng)在表現(xiàn)體內(nèi)組織結(jié)構(gòu)復(fù)雜性上的不足，擁有與體內(nèi)對應(yīng)器官相似的細(xì)胞構(gòu)成、組織結(jié)構(gòu)特征，能呈現(xiàn)較為復(fù)雜的生理功能，是體外模擬發(fā)育及疾病發(fā)生發(fā)展的重要工具。類器官模型的建立，使得在體外還原對應(yīng)組織器官的細(xì)胞類型、基因表達(dá)、組織結(jié)構(gòu)、生理功能及多種生物學(xué)過程成為可能。

合成生物學(xué)（synthetic biology）是系統(tǒng)生物學(xué)與基因技術(shù)、工程科學(xué)、合成化學(xué)、計(jì)算機(jī)科學(xué)等眾多學(xué)科交叉融合所催生的新興學(xué)科，以基因組和生化分子合成為基礎(chǔ)，綜合生物化學(xué)、生物物理和生物信息等技術(shù)，通過工程化、模塊化的方法，旨在設(shè)計(jì)、改造、重建生物分子、生物元件和生物分化過程，從而構(gòu)建具有生命活性的生物元件、系統(tǒng)以及人造細(xì)胞或生物體。

隨著類器官技術(shù)的不斷發(fā)展和對復(fù)雜類器官構(gòu)建的需求日益增加，現(xiàn)有類器官構(gòu)建方法的單一性、高可變性等缺陷逐漸顯露，需要拓展新的思路來實(shí)現(xiàn)類器官培養(yǎng)的優(yōu)化。而合成生物學(xué)系統(tǒng)化、模塊化、高通量的基本理念恰好契合類器官構(gòu)建與改良的需求。本文將簡要概述類器官的發(fā)展歷程，聚焦當(dāng)下前沿的類器官構(gòu)建體系中合成生物學(xué)思路的體現(xiàn)，以及類器官技術(shù)發(fā)展對合成生物學(xué)的潛在推動作用，闡述類器官與合成生物學(xué)之間相輔相成、相互促進(jìn)的關(guān)系，并展望二者融合碰撞所能產(chǎn)生的多種可能性。

1 類器官及合成生物學(xué)發(fā)展概述

1.1 類器官技術(shù)的起源及發(fā)展

類器官是基于多能干細(xì)胞或成體干細(xì)胞建立的體外3D培養(yǎng)物，具有人體相應(yīng)器官或組織的結(jié)構(gòu)和功能特征。雖然“organoid”一詞直到1946年才首次出現(xiàn)在文獻(xiàn)報(bào)道中，但對于類器官的研究，最早可以追溯到20世紀(jì)初。1907年，有研究表明解離的海綿細(xì)胞在合適的條件下可以自組織成細(xì)胞團(tuán)，并分化出新的個(gè)體。隨著研究的不斷深入，對細(xì)胞自組織的研究逐漸從無脊椎動物擴(kuò)展到兩棲動物、禽類乃至哺乳動物。2008年，Eiraku等使用3D聚集培養(yǎng)方法將胚胎干細(xì)胞分化為大腦皮層類似組織。2009年，Sato等的研究表明，特定條件下的成人腸干細(xì)胞可以在基質(zhì)中形成3D的小腸類器官，在沒有間充質(zhì)的情況下可以自組織并分化出小腸微絨毛結(jié)構(gòu)。這一具有里程碑意義的研究為之后許多類器官相關(guān)研究奠定了基礎(chǔ)，在此之后，針對不同胚層發(fā)育，包括胃、腎臟、肝臟、胰腺、肺、大腦和視網(wǎng)膜等，研究人員陸續(xù)建立了對應(yīng)的類器官培養(yǎng)方案[圖1(a)]。

圖1 類器官(a)及合成生物學(xué)(b)研究的重要時(shí)間節(jié)點(diǎn)

1.2 類器官模型的優(yōu)勢與局限性

近年來，越來越多的類器官模型得到了成功構(gòu)建，尤其是單一譜系來源的正常組織類器官或是病理性類器官模型，目前已經(jīng)有了相對成熟穩(wěn)定的培養(yǎng)方案，這些為人體組織器官發(fā)育、功能、疾病的研究提供了重要資源，同時(shí)對再生醫(yī)學(xué)和基因治療領(lǐng)域的發(fā)展也具有相當(dāng)有力的推動作用。

相比于傳統(tǒng)的2D細(xì)胞培養(yǎng)和動物模型，類器官可以提供更加接近人體內(nèi)組織結(jié)構(gòu)的3D微環(huán)境，重現(xiàn)體內(nèi)組織器官的細(xì)胞類型組成與功能。在疾病模型的構(gòu)建中，使用患者自體來源的細(xì)胞培養(yǎng)類器官，可以實(shí)現(xiàn)藥物在特定個(gè)體中的療效評估。此外，患者自體來源的類器官，也許能為患者提供可降低免疫排斥反應(yīng)的適合移植的組織，在損傷的再生修復(fù)以及器官移植領(lǐng)域有著廣闊的前景。

盡管類器官目前已經(jīng)可以在一定程度上模擬體內(nèi)組織的細(xì)胞組成、結(jié)構(gòu)與功能，但距離實(shí)現(xiàn)對體內(nèi)真實(shí)復(fù)雜生理結(jié)構(gòu)精確、穩(wěn)定的模擬，仍然有很長的一段路要走。此外，體外分化所培養(yǎng)的類器官在發(fā)育過程中往往存在明顯的異質(zhì)性，個(gè)體類器官之間的重復(fù)性較低，生成類器官的時(shí)間成本及資源成本均十分高昂，因此如何提升類器官開發(fā)的精確性、穩(wěn)定性以及分化效率是目前類器官研究面臨的一大關(guān)鍵挑戰(zhàn)。與此同時(shí)，單一譜系來源的簡單類器官已經(jīng)無法滿足日益增長的以類器官作為工具研究或重現(xiàn)體內(nèi)多譜系、多組織類型甚至是多系統(tǒng)之間的發(fā)育、組裝乃至互作的需求，因此更復(fù)雜、更綜合的類器官系統(tǒng)的構(gòu)建成為了當(dāng)下類器官技術(shù)的研究難點(diǎn)。想要攻克上述挑戰(zhàn)，建立起具有較低可變性、較高分化效率、較穩(wěn)定的可控性且擁有復(fù)雜穩(wěn)定結(jié)構(gòu)的類器官培養(yǎng)方案，則要求研究人員能夠?qū)崿F(xiàn)對類器官培養(yǎng)體系（包括細(xì)胞命運(yùn)及細(xì)胞外微環(huán)境）精準(zhǔn)、工程化的時(shí)空調(diào)控。這一需求與合成生物學(xué)的研究理念、研究目的高度一致。

當(dāng)下，類器官培養(yǎng)體系的設(shè)計(jì)已經(jīng)開始逐步展現(xiàn)出系統(tǒng)化、工程化的特點(diǎn)，一定程度上與合成生物學(xué)的研究理念產(chǎn)生了契合，而合成生物學(xué)領(lǐng)域的發(fā)展與越來越多的合成生物學(xué)工具的開發(fā)，也為更復(fù)雜、更精準(zhǔn)的類器官構(gòu)建提供了全新的角度與思路。此外，伴隨著類器官技術(shù)的發(fā)展，以類器官作為平臺所開展的許多研究，如類器官轉(zhuǎn)錄組圖譜的構(gòu)建、CRISPR篩選等，也可以推動與指導(dǎo)合成生物學(xué)的發(fā)展。

1.3 合成生物學(xué)的起源

分子生物學(xué)相關(guān)技術(shù)的發(fā)展，使得研究人員可以在體外對細(xì)胞或生物體的基因進(jìn)行操控，促進(jìn)了合成生物學(xué)的發(fā)展。2000年，Collins團(tuán)隊(duì)受噬菌體λ開關(guān)和藍(lán)藻晝夜節(jié)律振蕩器的啟發(fā)，設(shè)計(jì)合成了雙穩(wěn)態(tài)基因網(wǎng)絡(luò)開關(guān)；同年，Elowitz和Leibler基于負(fù)反饋調(diào)控機(jī)制實(shí)現(xiàn)了基因振蕩網(wǎng)絡(luò)的設(shè)計(jì)；2002年，Wimmer團(tuán)隊(duì)通過化學(xué)合成病毒基因組獲得了具有感染性的脊髓灰質(zhì)炎病毒，這也是首個(gè)人工合成的生命體；2010年，Venter團(tuán)隊(duì)設(shè)計(jì)、合成和組裝了1.08 Mb的支原體基因組（JCVI-syn1.0），并將其移植到山羊支原體受體細(xì)胞中，產(chǎn)生了僅由合成染色體控制的新支原體細(xì)胞；2014年，Romesberg團(tuán)隊(duì)設(shè)計(jì)合成了一個(gè)非天然堿基配對，并將它們整合到大腸桿菌基因組[圖1(b)]。這些研究表明，對生物系統(tǒng)進(jìn)行精準(zhǔn)的設(shè)計(jì)與調(diào)控，將進(jìn)一步加深對于生命系統(tǒng)的理解，拓展生命系統(tǒng)的可能性。

1.4 類器官與合成生物學(xué)的區(qū)別與聯(lián)系

類器官與合成生物學(xué)均為生命科學(xué)近年來興起的新興發(fā)展學(xué)科，在生物醫(yī)學(xué)研究中也逐漸展現(xiàn)出了廣闊的發(fā)展前景，二者有所聯(lián)系又互不相同。從研究目的上看，類器官構(gòu)建目標(biāo)是通過調(diào)控干細(xì)胞在3D培養(yǎng)條件下分化與自組裝，盡可能在體外還原體內(nèi)組織或器官的真實(shí)細(xì)胞類型、細(xì)胞組成、形態(tài)結(jié)構(gòu)、發(fā)育過程以及功能。而合成生物學(xué)則是在現(xiàn)有系統(tǒng)的基礎(chǔ)上重新進(jìn)行設(shè)計(jì)和改造，使之增加新的功能，或重新構(gòu)建全新的生物元件與系統(tǒng)。前者強(qiáng)調(diào)體內(nèi)真實(shí)組織的還原與重現(xiàn)，后者注重的是生物系統(tǒng)的重建與改造。

從研究方案上來看，傳統(tǒng)類器官的構(gòu)建通過模擬體內(nèi)正常生長分化過程的外源信號線索以及相應(yīng)的基因表達(dá)模式，利用干細(xì)胞自我更新與分化的能力，實(shí)現(xiàn)類器官模型的體外構(gòu)建。而合成生物學(xué)則是依托于對天然生物元件及其相互作用的理解，重新設(shè)計(jì)、修改、重構(gòu)生物元件和系統(tǒng)。

類器官與合成生物學(xué)兩大研究方向并沒有明晰的界限，前者可以幫助合成生物學(xué)研究人員更好地了解天然的生物系統(tǒng)中存在的分子機(jī)制以及相互作用的原理，后者可以在構(gòu)建類器官過程中實(shí)現(xiàn)對部分復(fù)雜功能的精準(zhǔn)調(diào)控。盡管目前合成生物學(xué)在類器官中的應(yīng)用還處于嘗試階段，但已展現(xiàn)出其明確的優(yōu)勢。探索合成生物學(xué)與類器官的區(qū)別與聯(lián)系，并進(jìn)一步闡述類器官構(gòu)建過程中合成生物學(xué)的策略體現(xiàn)以及合成生物學(xué)工具在類器官中的應(yīng)用，可以明確兩個(gè)研究方向相輔相成的關(guān)系，突破現(xiàn)有的研究瓶頸，推動兩個(gè)方向的發(fā)展與創(chuàng)新。

2 類器官構(gòu)建中的合成生物學(xué)策略的體現(xiàn)

合成生物學(xué)研究與應(yīng)用可體現(xiàn)為兩種形式：一是“自上而下”的方法，通過對現(xiàn)有的、天然存在的生物系統(tǒng)進(jìn)行重新設(shè)計(jì)和改造，修改已存在的生物系統(tǒng)，使之增添新的功能；二是“自下而上”的方法，通過設(shè)計(jì)和構(gòu)建新的生物元件、組件和系統(tǒng)，創(chuàng)造自然界中尚不存在的人工生命系統(tǒng)。

本節(jié)將以經(jīng)典的類器官構(gòu)建案例以及類器官模型的應(yīng)用，來闡述類器官構(gòu)建及優(yōu)化方案（圖2），以及合成生物學(xué)基礎(chǔ)路線和研究方法在類器官研究中的基本體現(xiàn)，進(jìn)一步說明合成生物學(xué)與類器官在研究思路與研究方案方面的區(qū)別與聯(lián)系。

圖2 類器官構(gòu)建與優(yōu)化策略

2.1 類器官構(gòu)建中微流控技術(shù)的應(yīng)用

在體內(nèi)，胚胎發(fā)育過程中組織或器官的發(fā)育受到嚴(yán)格的時(shí)空動態(tài)調(diào)控。通常來說，類器官的形態(tài)發(fā)生過程也會受到外部微環(huán)境因素的控制，干細(xì)胞在特定的時(shí)間點(diǎn)暴露于特定的外源性形態(tài)發(fā)生因子或生長因子時(shí)，往往存在相應(yīng)的發(fā)育信號通路的激活，從而觸發(fā)特定類型細(xì)胞的分化與自組織。通過對生理微環(huán)境因素的精確時(shí)空控制，改變類器官培養(yǎng)體系中外源因子的組合模式和劑量，是構(gòu)建不同類器官模型的基本思路。

早期的細(xì)胞2D分化研究是3D類器官構(gòu)建的基礎(chǔ)，結(jié)合3D培養(yǎng)的幾種方法，包括嵌入細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）和懸浮培養(yǎng)等，可使體外模型的構(gòu)建由2D轉(zhuǎn)變?yōu)?D，從而更好地還原組織器官的結(jié)構(gòu)與功能。目前，類器官最常見的設(shè)計(jì)思路是通過對體內(nèi)不同組織器官發(fā)育過程的理解，借鑒內(nèi)源性發(fā)育調(diào)控與穩(wěn)態(tài)維持的基本原理，在體外模擬細(xì)胞組成與調(diào)控信號，調(diào)控干細(xì)胞的增殖與分化，從而建立對應(yīng)特定組織或器官的3D模型。

2009年，荷蘭科學(xué)家Hans Clevers等在體外成功利用小鼠Lgr5+腸道干細(xì)胞構(gòu)建了小腸類器官，該研究建立的小腸類器官在很大程度上重現(xiàn)了體內(nèi)小腸組織的細(xì)胞類型與3D結(jié)構(gòu)，并能夠基本準(zhǔn)確地模擬小腸上皮的生理情況。該研究極大推動了類器官技術(shù)的發(fā)展，它證明了通過體內(nèi)分化條件的模擬，可成功實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的體外分化調(diào)控，為其他組織或器官的體外3D培養(yǎng)提供了可靠的實(shí)驗(yàn)性依據(jù)。此后，研究人員實(shí)現(xiàn)了不同類型3D培養(yǎng)，建立了多種人類正常和病理性類器官，如前文提到的腦、結(jié)腸、胃和肝臟類器官等。

盡管目前針對體內(nèi)多種組織與器官已經(jīng)有了對應(yīng)的分化方案與類器官模型，但僅通過向培養(yǎng)基中添加誘導(dǎo)因子來控制特定信號通路的激活或抑制，從而實(shí)現(xiàn)類器官誘導(dǎo)分化的傳統(tǒng)構(gòu)建思路也面臨明顯的局限性。對類器官的構(gòu)建而言，在分化的不同時(shí)間點(diǎn)添加不同的誘導(dǎo)因子可實(shí)現(xiàn)對干細(xì)胞命運(yùn)決定的時(shí)間調(diào)控，但空間上非對稱的信號調(diào)控，例如體軸發(fā)生過程中形態(tài)發(fā)生因子的梯度協(xié)同作用則難以模擬。此外，常規(guī)的類器官培養(yǎng)策略也難以模擬體內(nèi)微環(huán)境中物理因素（如機(jī)械應(yīng)力等）對于組織器官發(fā)育的影響。在類器官的應(yīng)用層面，將類器官模型應(yīng)用于藥物篩選或療效驗(yàn)證研究時(shí)，通常需要繁瑣的人工操作與較長的培養(yǎng)時(shí)間。不僅如此，樣品個(gè)體、批次之間在組織結(jié)構(gòu)、細(xì)胞組成等方面存在較大的異質(zhì)性，這也將影響實(shí)驗(yàn)的可重復(fù)性。此外，分析通量低也是目前類器官研究中亟待解決的困難。

針對以上問題，微流控技術(shù)被引入類器官培養(yǎng)中。器官芯片可以控制流體流動，結(jié)合細(xì)胞與細(xì)胞相互作用、基質(zhì)特性、生物化學(xué)和生物力學(xué)等調(diào)控，在時(shí)間尺度上實(shí)現(xiàn)對細(xì)胞命運(yùn)調(diào)控的同時(shí)，引入空間等多種變量，可更準(zhǔn)確地在體外模擬內(nèi)源組織的分化環(huán)境，也使得組織器官之間的相互作用及復(fù)雜功能得以更好實(shí)現(xiàn)。2016年，Christopher J. Demers等開發(fā)了一種微流控裝置，可以在類器官培養(yǎng)中產(chǎn)生形態(tài)發(fā)生因子梯度，模擬生理狀態(tài)下的形態(tài)梯度來分化產(chǎn)生神經(jīng)管模擬物。Rifes等利用微流控裝置中的Wnt梯度生成了一種具有喙尾組織特征的神經(jīng)組織，并將其用于模擬早期人類神經(jīng)管的發(fā)育。在成功實(shí)現(xiàn)了類器官構(gòu)建過程中空間上的信號調(diào)控的同時(shí)，也有研究致力于探索組織器官形成過程中物理因素對類器官生長發(fā)育及功能的影響。例如，通過人胃類器官的管腔流可以有節(jié)律地向類器官引入可控強(qiáng)度的拉伸和收縮，模擬體內(nèi)胃功能，用于人體胃生理學(xué)研究、疾病建模和藥物篩選。

除此之外，還有更多研究致力于在微流控裝置中整合類器官生長所需的物理或生化因素。2019年，Morizane團(tuán)隊(duì)通過設(shè)計(jì)3D打印的微流控芯片，在類器官培養(yǎng)過程中引入了可控的流體剪切力，在體外成功構(gòu)建了腎類器官。相比于靜態(tài)培養(yǎng)，該腎類器官極大擴(kuò)展了內(nèi)源性內(nèi)皮祖細(xì)胞池，生成了由壁細(xì)胞包圍的可灌注管腔的血管網(wǎng)絡(luò)，且具有更成熟的足細(xì)胞和腎小管。2018年，秦建華團(tuán)隊(duì)構(gòu)建了一種包含微柱陣列結(jié)構(gòu)的可灌注微流控裝置，該裝置可實(shí)現(xiàn)人多能干細(xì)胞向肝類器官分化的誘導(dǎo)。此種方法下產(chǎn)生的肝類器官具有更高的細(xì)胞活力與成熟度，且肝特異性功能顯著增強(qiáng)。2019年，一種可灌注的胰島類器官微流控芯片被建立，該芯片具有多層結(jié)構(gòu)，可以在單一設(shè)備中實(shí)現(xiàn)可控的類胚體形成、原位胰島分化、胰島類器官的形成與長期培養(yǎng)。與靜態(tài)培養(yǎng)的胰島類器官相比，該可灌注芯片培養(yǎng)分化的胰島類器官具有更完整的結(jié)構(gòu)、更高的細(xì)胞活性以及更強(qiáng)的胞間連接。

除細(xì)胞的時(shí)空命運(yùn)調(diào)控與物理因素的模擬外，微流控技術(shù)結(jié)合不同器官芯片的開發(fā)，也為類器官的構(gòu)建提供了高通量、高均一性、自動化、工程化的可能性。比如，通過微流控液滴技術(shù)，可將含有細(xì)胞的基質(zhì)膠剪切成均一化的微球，研究人員利用該平臺成功培養(yǎng)了小鼠肝、肺、腎等正常組織的類器官，以及癌癥病人肺、腎、胃、直腸等多種腫瘤類器官。對樣品進(jìn)行鑒定后證實(shí)了分化產(chǎn)生的樣品在形態(tài)與尺度上的均一性，且具有與源組織/腫瘤高度一致的細(xì)胞類型組成、組織病理學(xué)特性與基因表達(dá)特征，這些類器官在抗腫瘤藥物敏感性篩選實(shí)驗(yàn)中也被證明具有較高的準(zhǔn)確性。

上述研究表明，類器官模型的構(gòu)建正在經(jīng)歷不斷優(yōu)化。相較于早期簡單類器官的構(gòu)建，為了更好地模擬體內(nèi)復(fù)雜的生理過程，工程化、模塊化的復(fù)雜類器官構(gòu)建仍有較大的發(fā)展需求。結(jié)合器官微流控技術(shù)，類器官的體外構(gòu)建已經(jīng)開始走向了高通量、工程化的階段，細(xì)胞命運(yùn)的體外時(shí)空精確調(diào)控得以實(shí)現(xiàn)，改進(jìn)了類器官構(gòu)建過程中高異質(zhì)性、低效率的缺陷。

2.2 基因工程在類器官中的應(yīng)用

細(xì)胞增殖分化產(chǎn)生不同組織、器官的過程不僅受外源的信號調(diào)控，也與內(nèi)源性的基因表達(dá)程序高度相關(guān)。此外，許多疾病，尤其是腫瘤的產(chǎn)生過程，也普遍存在遺傳物質(zhì)的改變與惡性突變的積累。伴隨著分子生物學(xué)相關(guān)技術(shù)的快速發(fā)展，尤其是基因編輯技術(shù)的發(fā)展，對基因進(jìn)行靶向操縱的效率與準(zhǔn)確性不斷提高，越來越多的研究開始針對類器官進(jìn)行遺傳改造，從而探究人體器官發(fā)育調(diào)控機(jī)制，或解析腫瘤發(fā)生發(fā)展機(jī)制。

比如，Wnt信號通路是正常發(fā)育和腫瘤形成過程中的重要通路，而腺瘤性息肉病相關(guān)蛋白（adenomatous polyposis coli，APC）失活是Wnt信號通路中的重要事件。Liu等利用CRISPR的方法構(gòu)建了APC敲除（APCKO）的類器官，成功復(fù)現(xiàn)了人體中Wnt通路異常激活情況下的腫瘤表型。除了直接改變Wnt信號通路的基因，也可以通過編輯其他基因以實(shí)現(xiàn)對Wnt通路的調(diào)控。采用CRISPR介導(dǎo)的基因編輯，Lin與Meltzer團(tuán)隊(duì)在腫瘤類器官中發(fā)現(xiàn)了細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑2A（cyclin dependent kinase inhibitor 2A，CDKN2A）和腫瘤抑制蛋白p53（tumor protein P53，TP53）的突變能夠抵抗Wnt異常激活而引起的細(xì)胞凋亡，揭示了腫瘤生成過程中的環(huán)境適應(yīng)過程。

除了模擬體內(nèi)存在的基因表達(dá)模式來重現(xiàn)體內(nèi)分化或疾病產(chǎn)生外，對于體內(nèi)環(huán)境中不存在但具有高度研究意義的基因，也可以通過基因編輯的方式整合進(jìn)干細(xì)胞基因組中，并通過類器官模擬、跟蹤發(fā)育過程，拓寬對組織器官發(fā)育的理解。2021年，Alysson R. Muotri團(tuán)隊(duì)使用基因編輯技術(shù)將古人類中剪接調(diào)控因子神經(jīng)腫瘤腹側(cè)抗原1（neuro-oncological ventral antigen 1，NOVA1）突變型等位基因引入人類誘導(dǎo)多能性細(xì)胞，然后通過構(gòu)建皮質(zhì)類器官模擬腦發(fā)育，揭示了該突變位點(diǎn)在神經(jīng)發(fā)育過程中的關(guān)鍵作用。研究發(fā)現(xiàn)，NOVA1突變體的表達(dá)會導(dǎo)致突觸蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)蛋白的變化，影響谷氨酸能信號，引發(fā)神經(jīng)元連接的差異以及神經(jīng)元電生理的異質(zhì)性。該工作提出了NOVA1基因變異在現(xiàn)代人類背景下改變皮質(zhì)發(fā)育的假設(shè)，為人類腦進(jìn)化機(jī)制提供了線索。

2020年，Hans Clevers團(tuán)隊(duì)開發(fā)了一種名為CRISPR-HOT（CRISPR-Cas9-mediated homology-independent organoid transgenesis）的工具，利用非同源依賴的CRISPR技術(shù)，可快速高效地對人源類器官進(jìn)行基因敲入，并針對人源類器官中的特定基因進(jìn)行熒光標(biāo)記和可視化。這一技術(shù)為熒光敲入類器官引入了新方法，為研究組織器官中實(shí)時(shí)動態(tài)的細(xì)胞過程提供了高效的工具。此外，Jürgen Knoblich團(tuán)隊(duì)以腦類器官為研究主體，建立了CRISPR-LIGHT技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了在腦類器官中進(jìn)行數(shù)百個(gè)基因的并行篩查，并將該方法應(yīng)用于小頭畸形（microcephaly）研究中，確定了一系列與小頭畸形相關(guān)的基因。

總之，類器官中的基因編輯使研究人員能夠聚焦特定細(xì)胞類型、基因或信號調(diào)控通路，在類器官中重現(xiàn)正�；虍惓０l(fā)育過程，揭示疾病分子機(jī)制；同時(shí)，也可開發(fā)更多行之有效的類器官分析工具。通過基因編輯，不僅可以在體外實(shí)現(xiàn)類器官的疾病模型構(gòu)建，也可以引入原系統(tǒng)中不存在的基因表達(dá)模式，在現(xiàn)有的基礎(chǔ)上改造、重建新的生物元件及系統(tǒng)，本質(zhì)上與合成生物學(xué)中自上而下的設(shè)計(jì)思路有著高度相似性。

2.3 組織工程材料與類器官構(gòu)建

在類器官構(gòu)建過程中，除去外源性生化因素與物理因素對細(xì)胞命運(yùn)的時(shí)空調(diào)控，以及內(nèi)源性基因表達(dá)對分化方向的影響外，類器官的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)也是影響類器官分化結(jié)果的重要因素之一。一方面，目前用于在3D基質(zhì)模型中培養(yǎng)類器官的方法，可能會導(dǎo)致組織隨機(jī)發(fā)育，類器官體積較大時(shí)，類器官內(nèi)部細(xì)胞與外界環(huán)境的物質(zhì)交換受到限制，難以從外界獲取充足的氧氣與營養(yǎng)物質(zhì)，代謝廢物也難以得到有效排除。因此，類器官內(nèi)部細(xì)胞易出現(xiàn)氧化應(yīng)激、細(xì)胞死亡，限制了分化組織的大小與健康程度。體外培養(yǎng)的類器官一般也難以形成類似體內(nèi)的血管網(wǎng)絡(luò)，無法克服上述障礙。另一方面，僅僅依賴自組織產(chǎn)生的類器官往往只具有較為單一的組織結(jié)構(gòu)，在重現(xiàn)體內(nèi)真實(shí)復(fù)雜的結(jié)構(gòu)組成時(shí)具有一定的局限性。

為了解決上述問題，組織工程材料的添加或工程化支架的應(yīng)用為類器官構(gòu)建提供了一些新的思路。目前常用于類器官培養(yǎng)支架的材料包括重組蛛絲蛋白、脫細(xì)胞的胞外基質(zhì)或3D打印的生物材料等。其中一部分作為支架材料直接添加進(jìn)類器官培養(yǎng)中（如蛛絲蛋白等），為類器官形成與生長提供細(xì)胞附著生長的結(jié)構(gòu)支持；另一部分則與類器官芯片制備技術(shù)相結(jié)合，為類器官提供具有特定的襯底拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)或內(nèi)部結(jié)構(gòu)的支架，從而進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)特定微環(huán)境的構(gòu)建與穩(wěn)態(tài)維持。

2019年，Bortolomai等將3DⅠ型膠原支架與3% 1,4-丁二醇二縮水甘油醚（butanediol diglycidyl ether，BDDGE）交聯(lián)，再接種經(jīng)過基因修飾的胸腺上皮細(xì)胞。胸腺類器官交聯(lián)支架的一側(cè)為排列整齊的多孔結(jié)構(gòu)，類似于胸腺髓質(zhì)；另一側(cè)為孔隙較少但更堅(jiān)硬的纖維結(jié)構(gòu)，類似于胸腺皮質(zhì)。該膠原支架在高效完成物質(zhì)交換的同時(shí)保證了良好的細(xì)胞透性和支架定植能力。2020年，Lutolf研究團(tuán)隊(duì)開發(fā)了一種可以滲透氣體、營養(yǎng)物質(zhì)和大分子的支架，可以誘導(dǎo)腸干細(xì)胞形成管狀上皮，在結(jié)構(gòu)上，該管狀上皮具有可進(jìn)入的內(nèi)腔以及與體內(nèi)相似的隱窩和絨毛狀組織形態(tài)；在功能上，該管狀上皮組織是可灌注的，從而可以連續(xù)去除管腔表面的死細(xì)胞，延長人工組織的培養(yǎng)時(shí)長。該模型保留了腸道的關(guān)鍵生理特征，并具有顯著的再生能力。而在2021年，通過3D打印技術(shù)結(jié)合生物材料，研究人員提出了一種工程方法，解決了腦類器官的核心區(qū)域易壞死、細(xì)胞分化誘導(dǎo)因子（如小分子或蛋白等）擴(kuò)散受限等問題。在該研究中，通過使用聚己內(nèi)酯支架對腦類器官進(jìn)行培養(yǎng)，產(chǎn)生了經(jīng)過改造的扁平化腦類器官，它具有良好的擴(kuò)散條件，能更好地為其組織提供氧氣和營養(yǎng)，從而防止壞死組織核心的形成，有助于類器官在體外長期培養(yǎng)的維持。

上述研究主要為類器官的體外培養(yǎng)提供了特定的結(jié)構(gòu)支撐及為氧氣、營養(yǎng)物質(zhì)的擴(kuò)散提供條件，除此之外，工程學(xué)支架的可調(diào)性質(zhì)（包括生化成分與物理性質(zhì)等）也可為類器官的體外培養(yǎng)提供精細(xì)可控條件。比如，不同的胞外基質(zhì)剛度可以影響間充質(zhì)細(xì)胞的分化方向，如較硬的基質(zhì)（>30 kPa）促進(jìn)成骨分化，而較軟的基質(zhì)（<10 kPa）促進(jìn)成脂分化。2022年，研究人員制備了一種基于脫細(xì)胞的牛和人子宮內(nèi)膜衍生的水凝支架材料，體外構(gòu)建了鼠和人的子宮內(nèi)膜類器官。該研究中，作者探究了不同的洗滌劑對水凝膠進(jìn)行處理，以及將水凝膠與不同組分交聯(lián)對于類器官分化的影響，證明了不同的組分、不同的工程化支架處理方式可影響類器官的細(xì)胞排列、結(jié)構(gòu)乃至功能。

綜上，工程化的支架材料為類器官的構(gòu)建提供了復(fù)雜的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，有效促進(jìn)了組織細(xì)胞與外界環(huán)境的物質(zhì)交換，減少了類器官培養(yǎng)過程中細(xì)胞的氧化應(yīng)激與機(jī)械損傷，一定程度上促進(jìn)了類器官的分化成熟以及結(jié)構(gòu)、功能上的穩(wěn)定，有利于類器官的長期培養(yǎng)。不僅如此，工程化支架材料的可調(diào)性質(zhì)，甚至可以在一定程度上直接影響類器官的分化方向和結(jié)構(gòu)形成。此外，部分工程化支架結(jié)構(gòu)引入了非天然的附著材料，在體外為特定組織結(jié)構(gòu)提供了相應(yīng)的支撐作用，以模擬體內(nèi)的胞外微環(huán)境。結(jié)合3D打印技術(shù)及生物墨水，可使支架本身在結(jié)構(gòu)、材料、力學(xué)特性以及穩(wěn)定性上均符合工程學(xué)中程序化、模式化的特點(diǎn)。

2.4 融合類器官構(gòu)建

體內(nèi)真實(shí)的生理過程往往涉及多細(xì)胞類型、多組織、多系統(tǒng)的相互連接與相互作用，這使得在單一類器官構(gòu)建之外，也需要在體外培養(yǎng)出具有更豐富的細(xì)胞類型、更完整的譜系來源、更復(fù)雜的互作結(jié)構(gòu)的類器官。類器官融合培養(yǎng)即是針對該問題的探索。

2017年，研究人員在體外構(gòu)建了人多能干細(xì)胞衍生而來的內(nèi)側(cè)神經(jīng)節(jié)隆起（medial ganglionic eminence，MGE）與皮質(zhì)特異性的類器官，它們分別重現(xiàn)了體內(nèi)MGE與皮質(zhì)的發(fā)育過程。鈣成像結(jié)果顯示，培養(yǎng)的人內(nèi)側(cè)神經(jīng)節(jié)隆起類器官（hMGEO）和人皮質(zhì)類器官（hCO）中產(chǎn)生了生理功能性神經(jīng)元和神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)，這也提示著二者的功能成熟。將hMGEO與hCO進(jìn)行融合，研究人員發(fā)現(xiàn)中間神經(jīng)元可向皮層側(cè)遷移，這一發(fā)現(xiàn)重現(xiàn)了體內(nèi)中間神經(jīng)元由MGE向皮質(zhì)區(qū)切向遷移的過程。

融合類器官研究還體現(xiàn)在皮質(zhì)-運(yùn)動環(huán)路的體外構(gòu)建中。2020年，Paşca團(tuán)隊(duì)體外構(gòu)建了類似于大腦皮質(zhì)或脊髓/后腦的類器官，并與骨骼肌球體進(jìn)行組裝，生成了皮質(zhì)-運(yùn)動組裝體。結(jié)合病毒追蹤、鈣成像及膜片鉗技術(shù)，研究人員對該組裝體進(jìn)行了功能驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)皮質(zhì)神經(jīng)元存在向脊髓的投射，脊髓源性的神經(jīng)元與骨骼肌相連，對組裝體皮質(zhì)端進(jìn)行刺激可以誘發(fā)骨骼肌的強(qiáng)烈收縮。

以上研究都證實(shí)了不同的類器官可以實(shí)現(xiàn)體外組裝，從而建立類似于體內(nèi)不同腦區(qū)、組織譜系之間的相互作用。這為在體外構(gòu)建更復(fù)雜的類器官模型提供了依據(jù)，為理解發(fā)育和疾病的復(fù)雜過程提供了新思路與新方法。融合類器官相較于傳統(tǒng)的單一類器官，更接近于在體外進(jìn)行人為的“系統(tǒng)”的構(gòu)建。這一過程往往涉及不同種類類器官的分別分化、共培養(yǎng)與組裝，最終目的是在體外重現(xiàn)體內(nèi)各組織分化、遷移與相互作用及形成完整功能結(jié)構(gòu)的整體的過程。在構(gòu)建融合類器官的過程中，研究人員將原本復(fù)雜的多組織共發(fā)育問題拆分為了更清晰的多種簡單類器官的分化、組裝問題，這與合成生物學(xué)中精確化、模塊化的策略相契合，通過這樣的方式，復(fù)雜的結(jié)構(gòu)網(wǎng)絡(luò)被拆分為簡化的模塊，大大減少了系統(tǒng)構(gòu)建過程中的隨機(jī)性。

2.5 類器官構(gòu)建與生物傳感集成

在類器官的構(gòu)建過程中，對類器官狀態(tài)的實(shí)時(shí)監(jiān)控可以幫助研究人員更及時(shí)地觀測類器官的發(fā)育狀態(tài)，并根據(jù)實(shí)時(shí)反饋的結(jié)果及時(shí)優(yōu)化與調(diào)整方案。該過程需要將類器官構(gòu)建技術(shù)與生物傳感系統(tǒng)有效結(jié)合。2017年，Parker團(tuán)隊(duì)通過多材料3D打印構(gòu)建了一種心臟組織類器官芯片，該芯片整合了6種不同的功能性油墨，將生物傳感器導(dǎo)入培養(yǎng)系統(tǒng)中后，可以實(shí)現(xiàn)對層狀心臟組織自組裝過程的動態(tài)觀測。同年，研究人員將多功能的傳感器嵌入器官芯片，設(shè)計(jì)了一套完全集成的模塊化物理、生化和光學(xué)傳感平臺，利用此平臺，研究者在體外構(gòu)建了人類肝臟和心臟類器官模型并進(jìn)行了藥物篩選。類器官構(gòu)建與生物傳感系統(tǒng)的整合，使得類器官的分化過程，以及分化過程中的即時(shí)狀態(tài)可以被完整記錄、分析、處理，幫助研究人員系統(tǒng)地給予反饋，該策略可更好地推動類器官培養(yǎng)向著模塊化、穩(wěn)定化的方向發(fā)展。

綜上，研究人員在類器官構(gòu)建的優(yōu)化上已經(jīng)進(jìn)行了多方面的嘗試，類器官的構(gòu)建在傳統(tǒng)模式的基礎(chǔ)上，逐漸開始產(chǎn)生了高通量、低可變性、高精確性等需求。因此，類器官的優(yōu)化不僅需要在結(jié)構(gòu)與功能上更接近體內(nèi)真實(shí)狀態(tài)，也需要數(shù)字化、自動化、程序化、系統(tǒng)性的構(gòu)建方案來實(shí)現(xiàn)對類器官誘導(dǎo)分化的精準(zhǔn)調(diào)控、即時(shí)反饋與穩(wěn)定分化。在這一過程中，類器官構(gòu)建思路逐漸與合成生物學(xué)的研究思路產(chǎn)生了碰撞，其中，目前大多數(shù)優(yōu)化方案都受到了合成生物學(xué)“自上而下”的研究思路啟發(fā)，通過對現(xiàn)有天然的生物材料、元件及系統(tǒng)進(jìn)行人為的改造與優(yōu)化，來實(shí)現(xiàn)高效、準(zhǔn)確、穩(wěn)定的類器官構(gòu)建。而合成生物學(xué)“自下而上”的研究思路提出了人工生物系統(tǒng)的設(shè)計(jì)與構(gòu)建，為類器官的優(yōu)化提供了更大膽、更多元、更開放的研究思路與方向，或許將在未來推動類器官研究步入新的階段。

3 合成生物學(xué)在類器官中的應(yīng)用

類器官的逐步發(fā)展和不斷創(chuàng)新的研究路線一定程度上體現(xiàn)了合成生物學(xué)中系統(tǒng)性、模塊化的思想與理念，而合成生物學(xué)的研究思路與不斷開發(fā)完善的工具也為更復(fù)雜的類器官系統(tǒng)構(gòu)建提供了新的思路與靈感。

3.1 設(shè)計(jì)-構(gòu)建-測試-學(xué)習(xí)研究循環(huán)

合成生物學(xué)相關(guān)研究以“設(shè)計(jì)-構(gòu)建-測試-學(xué)習(xí)”（design-build-test-learn，DBTL）的研究循環(huán)作為核心路線[圖3(a)]。合成生物學(xué)一直在嘗試將工程原理引入生命科學(xué)，并推動生物元件的標(biāo)準(zhǔn)化和表征，以實(shí)現(xiàn)復(fù)雜生物元件、生物系統(tǒng)的可復(fù)制和可擴(kuò)展構(gòu)建。自動化、標(biāo)準(zhǔn)化與工程化地設(shè)計(jì)或改造生物元件，是合成生物學(xué)的初衷，而其中涉及的工程學(xué)思路與生命科學(xué)相結(jié)合的新模式，也為類器官構(gòu)建方案的設(shè)計(jì)與優(yōu)化提供了指導(dǎo)。

圖3 合成生物學(xué)研究路線(a)與常見的合成生物學(xué)工具(b)

其中，設(shè)計(jì)步驟依賴于充分表征的生物部件和計(jì)算機(jī)輔助方法。設(shè)計(jì)內(nèi)容包括控制基因轉(zhuǎn)錄、翻譯的各類手段，基因表達(dá)的各類調(diào)控方法，以及各類翻譯后修飾手段的選擇與組合。構(gòu)建步驟，各類先進(jìn)的核酸工具酶試劑盒、各種核酸修飾技術(shù)以及各類組合式文庫數(shù)據(jù)簡化重組載體的構(gòu)建過程，該步驟中可以實(shí)現(xiàn)組分到元件再到組件的逐步構(gòu)建，直至組合成完整的具有功能的生物系統(tǒng)。測試步驟主要依賴于微流控芯片及高通量篩選，監(jiān)測系統(tǒng)輸出，如熒光蛋白標(biāo)記；用于化合物檢測的液相色譜-質(zhì)譜（LC-MS）分析技術(shù)等，測試所構(gòu)建的生物元件是否穩(wěn)定、可重復(fù)且具有相應(yīng)的功能。在學(xué)習(xí)步驟中，采用各種計(jì)算機(jī)建模方法進(jìn)行深度學(xué)習(xí)并對設(shè)計(jì)及構(gòu)建過程進(jìn)行仿真和優(yōu)化。

這一研究循環(huán)在類器官的構(gòu)建過程中也有一定的體現(xiàn)，在新的類器官構(gòu)建方案的開發(fā)早期，研究人員需要明確所需構(gòu)建的類器官模型的體內(nèi)發(fā)育過程，包括發(fā)育的中間狀態(tài)及分化各階段的分子機(jī)制；基于明確的生物過程，研究人員需要設(shè)計(jì)合適的類器官體外培養(yǎng)條件，實(shí)現(xiàn)具有特定細(xì)胞類型及特定結(jié)構(gòu)的類器官體外分化誘導(dǎo)；在得到初步的模型后，需要對樣品進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察、免疫熒光染色、單細(xì)胞測序等，驗(yàn)證類器官的細(xì)胞組成、形態(tài)結(jié)構(gòu)以及與體內(nèi)組織的相似性；基于驗(yàn)證的結(jié)果，研究人員需要進(jìn)一步優(yōu)化培養(yǎng)條件直至獲得最優(yōu)、最穩(wěn)定的培養(yǎng)方案。在類器官構(gòu)建方案的開發(fā)中，這一循環(huán)往往需要面對漫長的時(shí)間和繁復(fù)的人工操作，而合成生物學(xué)結(jié)合計(jì)算機(jī)輔助及深度學(xué)習(xí)，可以大大提高測試與學(xué)習(xí)的進(jìn)程，指導(dǎo)類器官模型構(gòu)建步入工程化、高效化的階段。

3.2 合成生物學(xué)工具

近年來，多種合成生物學(xué)工具被應(yīng)用于生命科學(xué)研究中，這些工具的開發(fā)與完善，在類器官的研究中也展現(xiàn)了廣闊的發(fā)展前景[圖3(b)]。本小節(jié)將聚焦于現(xiàn)有及新興的合成生物學(xué)工具的原理及其在類器官構(gòu)建與優(yōu)化過程中的應(yīng)用與發(fā)展?jié)摿Α?/p>

3.2.1 光遺傳學(xué)工具

利用光遺傳學(xué)原理，可以設(shè)計(jì)基于光控開關(guān)的調(diào)控系統(tǒng)。由于光照控制的靈活性，可使刺激具有較高的空間和時(shí)間精度，因此光遺傳方法比傳統(tǒng)的藥物操作具有明顯優(yōu)勢。目前，光遺傳學(xué)工具在類器官的構(gòu)建中已有了廣泛的應(yīng)用。Repina等利用光遺傳學(xué)技術(shù)，在胚胎干細(xì)胞中激活Wnt/β-catenin信號通路，誘導(dǎo)了細(xì)胞的分化、遷移與分選。研究人員也可利用光遺傳技術(shù)在神經(jīng)類器官中局部激活SHH信號。結(jié)合高分辨率空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)和單細(xì)胞分析技術(shù)，研究人員發(fā)現(xiàn)這種局部誘導(dǎo)足以生成具備空間組織模式的類器官，并提出將光遺傳學(xué)擾動與空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)結(jié)合起來，重新編程并研究類器官中的不同細(xì)胞的命運(yùn)和組織模式的策略。

3.2.2 工程化的細(xì)胞近/遠(yuǎn)程通信調(diào)控

在發(fā)育過程中，細(xì)胞間相互交流與細(xì)胞的分化及形態(tài)發(fā)生相關(guān)，而可擴(kuò)散的形態(tài)發(fā)生因子及其梯度差異可以誘導(dǎo)特定細(xì)胞類型以不同空間順序分化，這些信號及其受體共同構(gòu)成了細(xì)胞近/遠(yuǎn)程通信網(wǎng)絡(luò)。利用合成生物學(xué)，在體外構(gòu)建短程或遠(yuǎn)程的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，可以實(shí)現(xiàn)類器官構(gòu)建過程中所需的細(xì)胞-細(xì)胞、細(xì)胞-基質(zhì)之間互作以及形態(tài)因子在濃度、梯度上的精確、可控的調(diào)控。

細(xì)胞表面受體作為通信網(wǎng)絡(luò)中不可或缺的一環(huán)，使細(xì)胞能夠檢測、處理和響應(yīng)胞外微環(huán)境的信息。近年來，合成生物學(xué)家基于天然受體的物理部件與概念進(jìn)行了合成受體的設(shè)計(jì)，使得細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與胞外環(huán)境間信號的感知-響應(yīng)過程可以被用戶定制。其中，在天然系統(tǒng)中，Notch信號通路是決定細(xì)胞命運(yùn)的重要通路之一，相鄰細(xì)胞通過Notch受體傳遞信號可以調(diào)節(jié)細(xì)胞的分化、增殖和凋亡�；�于Notch信號通路，合成生物學(xué)家合成了SynNotch系統(tǒng)，在該系統(tǒng)中，表達(dá)SynNotch受體的細(xì)胞識別呈遞用戶定義抗原的發(fā)送細(xì)胞，通過釋放經(jīng)工程改造的轉(zhuǎn)錄因子，誘導(dǎo)定制的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。該合成的SynNorch系統(tǒng)，可以應(yīng)用于類器官構(gòu)建過程中，一方面作為細(xì)胞-細(xì)胞作用的報(bào)告基因在3D組織中監(jiān)測細(xì)胞互作，另一方面可以定制特定的轉(zhuǎn)錄調(diào)控模式，誘導(dǎo)特定的形態(tài)發(fā)生因子及受體產(chǎn)生。目前，已經(jīng)有研究通過體外構(gòu)建帶有SynNotch的小鼠多能干細(xì)胞系，在2D的細(xì)胞培養(yǎng)及3D的小鼠嵌合胚胎培養(yǎng)中，成功識別了細(xì)胞與細(xì)胞的相互作用，并通過SynNotch激活神經(jīng)元分化因子neurogenin 1，當(dāng)這些受體細(xì)胞與發(fā)送細(xì)胞接觸時(shí)，兩者之間形成的邊界成功誘導(dǎo)了神經(jīng)元分化。

在SynNotch系統(tǒng)的基礎(chǔ)上，Lim團(tuán)隊(duì)構(gòu)建了可以識別GFP并進(jìn)行反應(yīng)的工程化受體，并將編碼這些受體的基因插入細(xì)胞，這些細(xì)胞與SynNotch系統(tǒng)結(jié)合后，構(gòu)成了可識別擴(kuò)散的信號分子的系統(tǒng)�；�于該系統(tǒng)，可以在類器官構(gòu)建過程中，實(shí)現(xiàn)用戶定義的細(xì)胞的遠(yuǎn)程信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，識別可擴(kuò)散的形態(tài)發(fā)生因子及相應(yīng)的濃度梯度并進(jìn)行響應(yīng)，使得細(xì)胞轉(zhuǎn)錄調(diào)控及非對稱性的形態(tài)發(fā)生在更為可控的條件下進(jìn)行。

3.2.3 工程化細(xì)胞黏附分子

差異黏附假說認(rèn)為，發(fā)育過程中液態(tài)組織的擴(kuò)散和細(xì)胞的分離現(xiàn)象源于組織表面張力，而組織表面張力源于細(xì)胞間黏附性的差異。細(xì)胞間黏附性的差異源于內(nèi)源性的黏附分子表達(dá)水平與鈣黏蛋白類型的差異，這將最終影響細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生以及細(xì)胞的自組裝。目前，合成生物學(xué)工具已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了對細(xì)胞進(jìn)行設(shè)計(jì)或重構(gòu)，從而影響其內(nèi)源性黏附分子的水平和類型，以實(shí)現(xiàn)對類器官培養(yǎng)過程中3D結(jié)構(gòu)的自組裝過程的間接調(diào)控。

2023年，Lim團(tuán)隊(duì)通過將正交的細(xì)胞外相互作用與天然黏附分子（如鈣黏蛋白和整合素）的細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域相結(jié)合，生成了多種合成的細(xì)胞黏附分子（synCAMs）。由此產(chǎn)生的分子產(chǎn)生了與天然相互作用相似的黏附特性的定制細(xì)胞-細(xì)胞相互作用。synCAMs胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的確定主導(dǎo)了界面形態(tài)和力學(xué)，而不同的同型或異型胞外相互作用結(jié)構(gòu)域獨(dú)立地確定了細(xì)胞間的連接。這種合成的正交黏附分子工具能夠合理地程序化組裝獨(dú)特的多細(xì)胞結(jié)構(gòu)，以及實(shí)現(xiàn)自然組織的系統(tǒng)性重塑�；�于此工具，類器官構(gòu)建過程中復(fù)雜且相對隨機(jī)的細(xì)胞自組裝過程能夠得到程序化的定義，充分降低類器官構(gòu)建的異質(zhì)性，也為類器官構(gòu)建過程中細(xì)胞類型及細(xì)胞互作的確定提供了有效的保障。

3.2.4 合成基因與工程化細(xì)胞命運(yùn)調(diào)控

細(xì)胞增殖、凋亡、遷移、分化是干細(xì)胞向更穩(wěn)定、具有更細(xì)化功能、更龐大的細(xì)胞群體過渡的基本過程，在發(fā)育過程中，控制細(xì)胞群體的大�。ò�括細(xì)胞數(shù)量和細(xì)胞類型比例）對于組織器官的形成及穩(wěn)定尤為重要。2023年，研究人員在哺乳動物細(xì)胞中設(shè)計(jì)并合成了一種系統(tǒng)，該系統(tǒng)可以在哺乳動物細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)生長素的產(chǎn)生與對生長素的響應(yīng)，并將其與控制細(xì)胞增殖與凋亡的基因相聯(lián)系，從而實(shí)現(xiàn)細(xì)胞種群密度的調(diào)控。該方案的實(shí)現(xiàn)使得細(xì)胞在體外培養(yǎng)過程中的數(shù)量及不同類型細(xì)胞比例能夠處于自發(fā)的、設(shè)計(jì)好的程序控制下，這在類器官構(gòu)建過程中十分必要。

對于細(xì)胞分化過程的發(fā)生，經(jīng)典表述認(rèn)為細(xì)胞的基因功能以及它們形成的復(fù)雜調(diào)控網(wǎng)絡(luò)在時(shí)空上控制了基因的表達(dá)量，從而編程了細(xì)胞命運(yùn)決定（fate determination）的過程。2023年，有研究根據(jù)定量實(shí)驗(yàn)和數(shù)理模型，通過基因撥動開關(guān)，探索細(xì)胞生長速率對經(jīng)典人工合成基因線路-互抑制回路的雙穩(wěn)態(tài)性的影響，發(fā)現(xiàn)了不同基因的表達(dá)量對生長速率呈現(xiàn)不平衡、不同步的響應(yīng)，進(jìn)而重塑細(xì)胞命運(yùn)決定景觀。基于不同的合成生物學(xué)基因線路，可以在體外實(shí)現(xiàn)對不同基因的表達(dá)調(diào)控，這使得針對類器官的細(xì)胞命運(yùn)決定篩選有了相應(yīng)的工具支持，當(dāng)需要對細(xì)胞命運(yùn)進(jìn)行程序化調(diào)控時(shí)，不同基因線路的排列組合可以使得細(xì)胞命運(yùn)置于工程化控制之下�？傊�，合成生物學(xué)能支持工程化的命運(yùn)控制，在類器官中精確調(diào)控細(xì)胞的增殖、分化、凋亡等與細(xì)胞命運(yùn)決定高度相關(guān)的事件，將復(fù)雜的組織生成過程拆分成更小的模塊，實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)調(diào)控。

與傳統(tǒng)的類器官構(gòu)建的模式相比，合成生物學(xué)工具能以更可控的方式，從細(xì)胞命運(yùn)決定、細(xì)胞通信、細(xì)胞自組織、細(xì)胞基因表達(dá)等多個(gè)方面對類器官的建立進(jìn)行調(diào)控，從而形成與人體組織器官更相似的類器官模型。合成生物學(xué)工具也為理解器官組織形態(tài)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)以及更好地設(shè)計(jì)類器官培養(yǎng)方案等提供了新方法。

4 類器官對合成生物學(xué)的推動

自21世紀(jì)初至今，合成生物學(xué)已經(jīng)經(jīng)歷了20多年高速發(fā)展的階段，新興的合成生物學(xué)工具的產(chǎn)生與相關(guān)合成生物學(xué)方法的構(gòu)建使得合成生物學(xué)的應(yīng)用方向越來越廣泛，包括細(xì)胞治療、藥物生產(chǎn)、生物材料合成等。但當(dāng)下合成生物學(xué)的發(fā)展也面臨著一定的挑戰(zhàn)。伴隨著類器官技術(shù)的不斷發(fā)展，以類器官作為平臺，目前已建立了多種系統(tǒng)性工具，以用于實(shí)現(xiàn)對組織器官發(fā)育、疾病發(fā)生發(fā)展、不同組織類型的細(xì)胞多樣性、遺傳信息變化等方面的分析。類器官在實(shí)現(xiàn)體內(nèi)組織器官的細(xì)胞類型與結(jié)構(gòu)重現(xiàn)的同時(shí)，具有與在體組織相比更易獲得的優(yōu)勢，這使得依托類器官可進(jìn)行高通量的篩選。系統(tǒng)性研究方法的應(yīng)用，可以使得研究人員對發(fā)育或疾病發(fā)生進(jìn)程有更全面精確的理解，也對合成生物學(xué)研究中系統(tǒng)性、模塊化、高精確性地設(shè)計(jì)生物學(xué)元件提供了基礎(chǔ)。本節(jié)將闡述合成生物學(xué)發(fā)展過程中面臨的挑戰(zhàn)與困難，并探討類器官及其衍生技術(shù)的發(fā)展對合成生物學(xué)研究的促進(jìn)與推動作用。

4.1 合成生物學(xué)發(fā)展面臨的挑戰(zhàn)

當(dāng)下，合成生物學(xué)仍然面臨諸多挑戰(zhàn)。比如，合成生物學(xué)的設(shè)計(jì)過程需要對天然生物元件及其相互作用，包括信號通路的激活、轉(zhuǎn)導(dǎo)以及下游相應(yīng)的過程有著全面且系統(tǒng)的把握，除此之外還需要大規(guī)模數(shù)據(jù)庫的支撐。但目前在真實(shí)的生物體中，仍然有大量的生物元件其功能、結(jié)構(gòu)以及互作模式尚未明確，且存在體內(nèi)樣本取樣難、數(shù)量少的問題。同時(shí)，合成生物學(xué)工具在改造現(xiàn)有系統(tǒng)之外，還涉及定制和動態(tài)合成基因組，這一過程高度依賴從組學(xué)實(shí)驗(yàn)中獲得的全細(xì)胞模擬與深度學(xué)習(xí)，這對數(shù)據(jù)庫有了更高的需求。此外，合成生物學(xué)工具需要大規(guī)模的平臺進(jìn)行學(xué)習(xí)與測試，這需要高通量、可控制的載體作為基礎(chǔ)。因此，類器官模型作為可以在體外高效模擬體內(nèi)微環(huán)境的工具，可以提高合成生物學(xué)工具測試、學(xué)習(xí)、重構(gòu)過程的效率及準(zhǔn)確性�；�于類器官模型衍生的組學(xué)研究及高通量的篩選，也可以使得合成生物學(xué)家能更好地把握天然生物系統(tǒng)中的分子機(jī)制與相應(yīng)的生物學(xué)過程。

4.2 類器官轉(zhuǎn)錄圖譜

如何評估類器官的質(zhì)量，是類器官構(gòu)建中的基本問題之一。除了理解類器官的體外分化效率、異質(zhì)性外，類器官與體內(nèi)組織器官的相似度如何是類器官質(zhì)量控制的關(guān)鍵內(nèi)容。相對于傳統(tǒng)的形態(tài)觀察、切片染色方法，高通量的單細(xì)胞測序技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)對單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行遺傳物質(zhì)的分析。從細(xì)胞類型和基因表達(dá)模式上對類器官與體內(nèi)組織進(jìn)行更精準(zhǔn)的比較分析，可更直觀地研判二者的一致性。同時(shí)，研究人員也可以根據(jù)二者細(xì)胞類型和基因表達(dá)差異來對類器官構(gòu)建方法進(jìn)行改進(jìn)。2015年，Treutlein團(tuán)隊(duì)將單細(xì)胞測序技術(shù)與類器官構(gòu)建結(jié)合，對腦類器官與胎兒新皮質(zhì)的細(xì)胞組成以及祖細(xì)胞至神經(jīng)元之間的譜系關(guān)系進(jìn)行了分析比較，發(fā)現(xiàn)在他們所培養(yǎng)的腦類器官中，皮質(zhì)細(xì)胞通過與胎兒組織高度相似的基因表達(dá)程序組織成大腦皮質(zhì)樣區(qū)域。這為在腦類器官培養(yǎng)中研究人類皮質(zhì)發(fā)育的遺傳特征提供了理論依據(jù)。

類似的工具還應(yīng)用于驗(yàn)證類器官的不同發(fā)育階段與體內(nèi)組織器官不同發(fā)育階段的一致性上。2022年9月，Paola Arlotta團(tuán)隊(duì)對培養(yǎng)23天到6個(gè)月共8個(gè)不同發(fā)育階段的皮質(zhì)類器官進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組、表觀組和空間轉(zhuǎn)錄組等多個(gè)水平的單細(xì)胞測序，通過對結(jié)果進(jìn)行分析，揭示了皮質(zhì)類器官發(fā)育過程中的細(xì)胞多樣性以及其與腦發(fā)育的一致性，且這種一致性不受代謝狀態(tài)的影響。這也證實(shí)了人腦類器官在研究人腦發(fā)育和細(xì)胞命運(yùn)決定中的重要作用。基于不同發(fā)育時(shí)間點(diǎn)的類器官轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，也讓研究人員更好地理解器官發(fā)育過程中的細(xì)胞類型發(fā)生與基因表達(dá)調(diào)控變化。

2023年，Paşca實(shí)驗(yàn)室為了更系統(tǒng)地理解形態(tài)發(fā)生素在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育以及神經(jīng)類器官體外分化培養(yǎng)過程中發(fā)揮的作用，建立了人類神經(jīng)細(xì)胞命運(yùn)規(guī)范的形態(tài)發(fā)生圖譜，為類器官體外誘導(dǎo)分化培養(yǎng)的條件選擇提供了一定的指導(dǎo)。同年，He Zhisong等整合了現(xiàn)有的26個(gè)方案的36個(gè)單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，收集到了一個(gè)超過170萬細(xì)胞的完整的人類神經(jīng)類器官細(xì)胞圖譜，該圖譜有助于評估神經(jīng)類器官的保真度，表征受干擾和患病狀態(tài)，并促進(jìn)未來分化方案的制定。

隨著越來越完善的單細(xì)胞測序方法和越來越多的類器官單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的產(chǎn)生，人們可以系統(tǒng)地認(rèn)識特定類器官或類細(xì)胞群體在發(fā)育過程中的調(diào)控，理解同一類型類器官不同分化方案產(chǎn)生的樣本之間的異同。因此，這些探索有助于全面理解器官發(fā)育、疾病發(fā)生，為以后系統(tǒng)性、程序化的類器官培養(yǎng)體系的設(shè)計(jì)提供理論基礎(chǔ)。利用類器官樣本與體內(nèi)組織相比更易獲得的優(yōu)勢，尤其如腦組織等可及性低的體內(nèi)組織，基于類器官的轉(zhuǎn)錄圖譜的構(gòu)建，合成生物學(xué)研究者也可以便利地研究組織器官發(fā)育、不同信號通路以及疾病發(fā)生發(fā)展過程中相關(guān)的基因功能，從而更好地設(shè)計(jì)生物元件、系統(tǒng)以及相關(guān)的合成生物學(xué)工具。

4.3 類器官CRISPR篩選

CRISPR篩選是認(rèn)識基因功能的有力工具。隨著體外高通量培養(yǎng)類器官方法的完善，以類器官為平臺的CRISPR篩選在研究器官發(fā)育、疾病發(fā)生、組織再生等方面都展現(xiàn)出了顯著優(yōu)勢。

2022年，基于6個(gè)轉(zhuǎn)錄因子的可誘導(dǎo)表達(dá)，研究人員建立了一個(gè)高效的小膠質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞分化方案。研究人員在該系統(tǒng)中建立了可誘導(dǎo)的CRISPR干擾和激活，并針對“可靶向基因組”進(jìn)行了3次篩選。這些篩選的結(jié)果揭示了控制小膠質(zhì)細(xì)胞存活、活化和吞噬功能的基因，從而有助于實(shí)現(xiàn)對小膠質(zhì)細(xì)胞的功能表征和治療靶向。在此之前的研究中，Pașca團(tuán)隊(duì)建立了皮質(zhì)類器官與類似皮質(zhì)下結(jié)構(gòu)的類器官，將二者融合培養(yǎng)建立了類器官組裝體，模擬了前腦中間神經(jīng)元的切向遷移過程。2023年，基于該組裝體模型，研究人員以425個(gè)孤獨(dú)癥障礙譜系以及其他神經(jīng)發(fā)育障礙疾病的相關(guān)基因作為候選進(jìn)行了CRISPR篩選，發(fā)現(xiàn)了13個(gè)影響中間神經(jīng)元分化的基因，以及33個(gè)影響中間神經(jīng)元遷移的基因。

目前，結(jié)合類器官的CRISPR篩選填補(bǔ)了體內(nèi)部分組織細(xì)胞難以獲取的局限性，使得一些可及性較差的組織的發(fā)育過程能在體外得到重現(xiàn)，同時(shí)針對疾病模型或相應(yīng)藥物靶點(diǎn)進(jìn)行篩選，也為許多藥物的開發(fā)提供了與體內(nèi)組織高度一致的臨床前模型，有助于疾病發(fā)生發(fā)展機(jī)制與疾病相關(guān)藥物靶點(diǎn)的探索。這些實(shí)踐也有助于合成生物學(xué)研究者更好地了解疾病模型，把握與疾病發(fā)生發(fā)展以及藥物作用相關(guān)的機(jī)制，促進(jìn)合成生物學(xué)工具在臨床上的研發(fā)與應(yīng)用。

總結(jié)與展望

本文概述了類器官及合成生物學(xué)的發(fā)展過程，并探討了傳統(tǒng)類器官構(gòu)建及優(yōu)化過程中體現(xiàn)的合成生物學(xué)策略，以及合成生物學(xué)工具在類器官優(yōu)化及類器官功能擴(kuò)充中的作用。在類器官與合成生物學(xué)協(xié)同發(fā)展中，值得關(guān)注的代表性方向包括利用類器官模型促進(jìn)生物元件設(shè)計(jì)。比如，類器官衍生的組學(xué)圖譜構(gòu)建以及高通量CRISPR篩選，可為合成生物學(xué)的設(shè)計(jì)與構(gòu)建提供更便利、全面、完善的數(shù)據(jù)基礎(chǔ)，使得合成生物學(xué)研究人員能夠更快、更容易地把握相應(yīng)的生物學(xué)過程，探索可合成的生物元件。又如，合成生物學(xué)面臨的一個(gè)重大挑戰(zhàn)是設(shè)計(jì)細(xì)胞的分化和特化，以便在合成多細(xì)胞系統(tǒng)中進(jìn)行有效和富有成果的分工。到目前為止，合成生物學(xué)主要集中在通過單一任務(wù)設(shè)計(jì)的種群中的每個(gè)細(xì)胞上。而類器官與合成生物學(xué)的結(jié)合有望在未來實(shí)現(xiàn)具有特定功能的合成器官的體外構(gòu)建，能夠在體外精確、可調(diào)控地構(gòu)建特定的組織與器官并實(shí)現(xiàn)相應(yīng)的功能。

對類器官模型的體外構(gòu)建而言，目前也存在一定的技術(shù)限制，比如煩瑣的人工操作、較高的個(gè)體間與批次間差異、部分類型的類器官需要較長的培養(yǎng)時(shí)間等。尤其是針對結(jié)構(gòu)或譜系組成復(fù)雜的類器官的構(gòu)建，該過程高度依賴于對培養(yǎng)環(huán)境以及細(xì)胞命運(yùn)的精準(zhǔn)調(diào)控。如何在類器官構(gòu)建中借力合成生物學(xué)原理與技術(shù)，是值得關(guān)注的發(fā)展方向。以目前常用的動物來源的基質(zhì)膠使用為例，該材料存在批次間差異，且無法完全還原體內(nèi)正常組織的結(jié)構(gòu)，因此成為類器官優(yōu)化構(gòu)建的瓶頸之一。結(jié)合合成生物學(xué)相關(guān)元件目前已經(jīng)可以實(shí)現(xiàn)基因的可編程性調(diào)控，但在胞外環(huán)境的重構(gòu)方面仍需要進(jìn)一步優(yōu)化和探索。比如，具有DNA編碼特性的材料已經(jīng)有了一定的研究，可基于此在體外高效生產(chǎn)工程化的生物材料，或許可在未來為類器官構(gòu)建時(shí)的胞外環(huán)境需求提供潛在解決方案。

總之，在過去十多年，作為體內(nèi)組織器官在體外的3D微縮模型，類器官技術(shù)已得到廣泛應(yīng)用。將類器官技術(shù)與合成生物學(xué)相結(jié)合，可以彌補(bǔ)構(gòu)建類器官過程中存在的一些限制�；�于類器官模型的多種合成生物技術(shù)或原理的整合，也為合成生物學(xué)在體外精準(zhǔn)操控生物元件的合成與重構(gòu)等方面提供了有效的實(shí)踐平臺。在發(fā)展的過程中，類器官與合成生物學(xué)兩者相輔相成，其協(xié)同發(fā)展將有望為今后研究人體器官、組織提供更優(yōu)的生理相關(guān)模型，也有望進(jìn)一步促進(jìn)合成生物學(xué)工具的開發(fā)與實(shí)踐。