FIDA在確定ReS19-T與阿爾茲海默癥治療新靶點(diǎn)作用機(jī)制中的應(yīng)用

研究背景：利用FIDA確定ReS19-T與阿爾茲海默癥治療新靶點(diǎn)作用機(jī)制
異常鈣信號是阿爾茨海默病（AD）的核心病理組成部分。本研究篩選出了ReS19-T的化合物，它能夠在基于細(xì)胞的tau病理模型中恢復(fù)鈣穩(wěn)態(tài)。異常的tau積累導(dǎo)致通過重塑細(xì)胞皮質(zhì)的septin絲體不受控制地激活儲存操作鈣通道（SOCCs）。ReS19-T與septin結(jié)合，可以在疾病狀態(tài)下恢復(fù)絲體的組裝，并抑制SOCCs的鈣離子進(jìn)入。在由淀粉樣β和tau驅(qū)動的小鼠疾病模型中，ReS19-T藥物恢復(fù)突觸可塑性，使腦網(wǎng)絡(luò)活動正�；�，并減輕淀粉樣蛋白β和tau病理的發(fā)展。研究結(jié)果確定了septin細(xì)胞骨架是開發(fā)疾病修飾性AD治療的潛在治療靶點(diǎn)。
 

FIDA技術(shù)的關(guān)鍵作用
這項(xiàng)研究中，層流誘導(dǎo)分散分析（FIDA）技術(shù)發(fā)揮了至關(guān)重要的作用。文章中，由于septin蛋白容易聚集，導(dǎo)致常規(guī)互作技術(shù)無法得到有效數(shù)據(jù)，F(xiàn)IDA技術(shù)采用無需標(biāo)記和無需固定的方式，完全的In-solution Labelfree，解決了蛋白因?yàn)楣潭ɑ驑?biāo)記導(dǎo)致的分子結(jié)構(gòu)與功能的異常的問題，而且FIDA通過同步的粒徑（Rh）與構(gòu)象（BRIC）分析對親和力進(jìn)行了兩維表征。利用FIDA，研究人員精確測量了ReS19-T化合物與無標(biāo)記的septin 6絲狀蛋白的高親和力結(jié)合，揭示了通過ReS19-T與septin 6的結(jié)合來恢復(fù)septin絲狀結(jié)構(gòu)的完整性，進(jìn)而防止了病理狀態(tài)下SOCCs的異常激活，這對于理解ReS19-T的藥理作用機(jī)制至關(guān)重要。
 

研究思路
通過篩選內(nèi)部化合物庫識別出具有保護(hù)作用的化合物ReS19-T，并進(jìn)行三雜交確定SEPT6為待選高親和力靶點(diǎn)

通過開發(fā)細(xì)胞基礎(chǔ)篩選測定，模擬tau和鈣引起的神經(jīng)毒性，篩選內(nèi)部化合物庫，發(fā)現(xiàn)了具有保護(hù)作用的化合物ReS19-T及其衍生物。研究表明，REM127是最有效的化合物，能夠降低細(xì)胞內(nèi)鈣濃度并對抗tau和淀粉樣蛋白引起的神經(jīng)毒性。此外，SEPT6被確定為ReS19-T的主要靶點(diǎn)，與ReS19-T有較強(qiáng)的結(jié)合能力，可能與tau及細(xì)胞骨架的關(guān)系密切。
 

圖1通過多輪篩選確定REM127（ReS19-T），是該系列中最有效的化合物，降低毒性和[Ca2+]細(xì)胞，中位有效濃度（ec50）分別為15和19 nM（圖1A），但對tau表達(dá)或atra依賴的基因轉(zhuǎn)錄沒有影響（C和D）
 

圖2，胞內(nèi)相互作用，不同septin亞型的MFC （REM929 - linked to甲氨蝶呤）（N = 3，誤差條表示SD）。插圖顯示了在三雜交實(shí)驗(yàn)中探測到的septin同種異構(gòu)體的系統(tǒng)發(fā)育分析

利用FIDA labelfree確定REM127（ReS19-T）與純化的septin同種型的結(jié)合親和力
文章中檢測了小分子REM127（ReS19-T）與純化的septin同種型的結(jié)合，使用層流誘導(dǎo)分散分析（FIDA），無標(biāo)記和無固定化的通過測量水動力學(xué)半徑大�。≧h）和構(gòu)象（BRIC）的變化來量化生物分子相互作用。在這些實(shí)驗(yàn)中，septin同種型在高鹽條件下維持，以防止聚集。REM127誘導(dǎo)了SEPT6的水動力半徑（Rh）的濃度依賴性增加，當(dāng)將其擬合到結(jié)合曲線時，計(jì)算出表觀解離常數(shù)（Kd_app）為1.5 nM�；�于構(gòu)象的結(jié)合相關(guān)熒光強(qiáng)度變化（BRIC）測量Kd_app也得到了相近的值1.6 nM（圖3A，D）。

對于SEPT7和SEPT2未檢測到化合物誘導(dǎo)的水動力半徑變化。這些體外結(jié)合研究表明REM127直接與SEPT6高親和力結(jié)合，并可能影響靶點(diǎn)構(gòu)象。研究還提供了REM127與SEPT7和SEPT2之間較弱結(jié)合的證據(jù)。
 

圖3 REM127與SEPT6的親和力曲線，（A）水動力學(xué)半徑（Rh）擬合的親和力曲線（D）BRIC擬合的親和力曲線（B）(C)分別為REM127與SEPT7和SEPT2之間親和力曲線

在驗(yàn)證REM127與SEPT6具有高親和力后進(jìn)一步探討其在調(diào)節(jié)SOCE和鈣穩(wěn)態(tài)中的作用

SEPT6的沉默會降低REM127對毒性和細(xì)胞內(nèi)鈣濃度的抑制作用，表明SEPT6在藥效中的重要性。tauP301L顯著增加細(xì)胞內(nèi)鈣濃度和SOCE的振幅，而REM127能夠恢復(fù)這些指標(biāo)至正常水平。SOCE在tauP301L狀態(tài)下被激活，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣過載，并可通過靶向SEPT6或抑制SOC通道來緩解毒性。所以REM127通過抑制tau誘導(dǎo)的SOCE及其對SEPT6的高親和力結(jié)合，恢復(fù)鈣穩(wěn)態(tài)，從而有望作為治療阿爾茨海默病的候選藥物。

圖4，tauP301L顯著增加細(xì)胞內(nèi)鈣濃度和SOCE的振幅REM127能夠恢復(fù)這些指標(biāo)

ReS19-T調(diào)節(jié)septin可恢復(fù)患者源性iPSC神經(jīng)元和AD小鼠模型的網(wǎng)絡(luò)功能并減輕AD病理發(fā)展

在表達(dá)人tauP301S（一種引起FTD的突變）或攜帶AD家族突變V717I （APP- ln）的APP London突變的轉(zhuǎn)基因小鼠中，研究了REM127對突觸可塑性的影響。兩種神經(jīng)退行性變模型均顯示海馬CA1區(qū)長期增強(qiáng)（LTP）的嚴(yán)重缺陷（圖C和D），這是一種與學(xué)習(xí)和記憶相關(guān)的突觸效能的活性和鈣依賴性增加形式�？诜�REM127可恢復(fù)tauP301S和APP-Ln小鼠的LTP（圖C和D）。用該化合物治療7天足以恢復(fù)APP-Ln小鼠的LTP（圖D）
 

圖5（C）WT和tauP301S小鼠（3.5月齡，每組N = 8）給予載藥或REM127 （20 mg/kg/天）2個月CA1 LTP。箭頭表示LTP誘導(dǎo)刺激。(D) WT/Veh （N = 5）、APP-Ln/Veh （N = 8）和APP-Ln/REM127 （N = 6）小鼠（7月齡）灌胃或REM127 （20 mg/kg/天）7 D后CA1 LTP的變化

除了介導(dǎo)神經(jīng)元變性外，異常鈣信號被認(rèn)為促進(jìn)了AD病理的發(fā)展。因此，我們假設(shè)通過ReS19-T抑制病變神經(jīng)元中的鈣內(nèi)流可以減輕AD小鼠模型的病理。雙源性APP-Ln的治療：PS1（A246E）用REM127治療3個月后，新皮質(zhì)（圖7）和托下（連接內(nèi)鼻皮層和海馬體的結(jié)構(gòu)）中的Ab斑塊堆積減少了55%至60%。這兩個大腦區(qū)域都很突出。
 

圖6（A至D） APP-Ln:PS1（A246E）小鼠3個月后給藥（N = 16）或口服REM127 (N = 12)，劑量為20mg /kg/天。（A至C）抗淀粉樣蛋白原纖維染色的Ab斑塊皮質(zhì)[(A)和(B)]和托骨下[(A)和(C)]的LOC抗體。(D)皮層CD11b免疫反應(yīng)性

FIDA的技術(shù)優(yōu)勢

1. 無需標(biāo)記和固定：對于大多數(shù)小分子與蛋白互作實(shí)驗(yàn)可以通過FIDA的280nm光學(xué)模塊無標(biāo)記的Labelfree方式檢測，F(xiàn)IDA技術(shù)無需固定、無需加熱，無需標(biāo)記。

2. 數(shù)據(jù)QC與正交驗(yàn)證：FIDA技術(shù)提供的是第一性原理的水動力學(xué)絕對值檢測，因此數(shù)據(jù)準(zhǔn)確可靠�？赏�步構(gòu)象改變(BRIC)進(jìn)行正交親和力驗(yàn)證。并可在實(shí)驗(yàn)的全流程進(jìn)行樣品的8個關(guān)鍵質(zhì)量參數(shù)的質(zhì)控。

3. 靈敏度高：FIDA技術(shù)的靈敏度極高，并能夠檢測到小于1%的Rh變化，這對于評估小分子藥物的結(jié)合親和力等參數(shù)非常有用。

4. 樣品消耗少：本實(shí)驗(yàn)中 SEPT7 濃度為6 uM，單次檢測只需要40nL，只需要極少量的蛋白樣品，分析物（REM127）從0-250nM完成滴定。