DEEPscope在多光子顯微鏡在LFOV、深層和高分辨率成像中的應用

大規(guī)模神經(jīng)元活動的體內(nèi)成像在解開大腦電路的功能中起著舉足輕重的作用。多光子顯微鏡作為深層組織成像的有力工具，在提升其成像速度、拓展視野以及增加成像深度等方面一直備受關(guān)注。不過，由于要避免在散射生物組織時出現(xiàn)熱損傷的情況，所以隨著成像深度不斷增加，視野會呈現(xiàn)出指數(shù)級的縮減。

在此背景下，美國康奈爾大學的Chris Xu教授團隊提出了一系列創(chuàng)新舉措，旨在對三光子顯微鏡進行優(yōu)化，使其能夠在雙光子顯微鏡無法觸及的深度實現(xiàn)大視場成像。憑借這些技術(shù)，可以在小鼠大腦最深的皮質(zhì)層中，針對那些表達蛋白質(zhì)鈣傳感器的轉(zhuǎn)基因動物，以單細胞分辨率，在直徑約為3.5毫米的視場內(nèi)，對其神經(jīng)元活動進行成像。

該團隊還進一步展示了多種成像成果，包括同時進行的大視場雙光子和三光子成像、在小鼠大腦中的皮質(zhì)下成像，以及針對成年斑馬魚的全腦成像。

研究背景
在許多生物領(lǐng)域，對完整組織進行大視場（LFOV）且具有高空間和時間分辨率的深度成像至關(guān)重要。它有助于深入了解生物組織的內(nèi)部結(jié)構(gòu)和功能，例如在神經(jīng)科學中對大腦神經(jīng)元活動的研究。

近年來，2PM技術(shù)有所進步，能實現(xiàn)一定體積的LFOV神經(jīng)活動記錄，如達到約的體積且?guī)�率約為2Hz，但成像深度局限于皮質(zhì)淺層。雖然3PM可對深層皮質(zhì)層、亞板和皮層下區(qū)域成像，突破了2PM的深度限制，能提供2PM無法觸及區(qū)域的光學通路。然而，為避免生物組織熱損傷，3PM需要低激光重復率，這限制了每秒可成像的像素數(shù)量，導致其成像視場通常較小，如在一些研究中，成像視場局限在幾百微米。

同時，在LFOV和深度成像中，熒光信號產(chǎn)生也是2PM和3PM技術(shù)面臨的重大挑戰(zhàn)。對于3PM來說，由于其依賴更高階非線性激發(fā)，相比2PM更難以通過降低光學分辨率來增加成像通量以擴大視場。

DEEPscope顯微鏡設計
1、激發(fā)源
3PM激發(fā)源：采用非共線光學參量放大器（NOPA）作為核心部件，由放大器（Spirit）進行泵浦。其中心波長設定為1320nm，重復率約為2MHz，平均功率可達約2W，每個脈沖的能量約為1μJ。為實現(xiàn)自適應激發(fā)功能，搭配了電光調(diào)制器（EOM）。同時，使用兩棱鏡（SF11玻璃）壓縮機來補償光學系統(tǒng)中的正常色散。經(jīng)過色散補償后，在物鏡下的脈沖持續(xù)時間約為60fs。

2PM激發(fā)源：選用鎖模Ti:Sapphire激光，中心波長為 920nm，具有80MHz的高重復率，平均功率約為1.6W。同樣配備EOM用于自適應激發(fā)，并且也使用兩棱鏡壓縮機來補償光學系統(tǒng)的正常色散。經(jīng)過色散補償后，在物鏡下的脈沖持續(xù)時間約為90fs。

2、光束生成延遲線
主要作用是將1320nm的激光脈沖分裂為兩個具有特定時間延遲的脈沖（光束），以此提高有效激光重復率。其結(jié)構(gòu)是一個由四個一英寸介質(zhì)鏡和一個偏振分束器立方體（PBS）組成的環(huán)形。

PBS作為整個延遲線的輸入和輸出端口，通過調(diào)整位于PBS之前的半波片（HWP）來控制每個光束的功率分布。在環(huán)形結(jié)構(gòu)內(nèi)部，通過傾斜兩個鏡子來調(diào)整光束之間的角度分離，使它們在垂直于掃描方向的平面上收斂于多邊形掃描儀。

為補償光束之間的發(fā)散差異，在環(huán)內(nèi)設置了一個8-f系統(tǒng)。最終在沿慢Y軸方向上創(chuàng)建了兩個相距約3μm的共面焦點。

3、掃描系統(tǒng)
多邊形掃描儀和相關(guān)配置
采用9-mm孔徑多邊形掃描儀和10-mm孔徑振鏡（galvo-mirror），通過兩個定制掃描透鏡（）進行共軛。多邊形掃描儀具有12個面，每個面的清晰孔徑為17.5mm×9.5mm。

由于光束在每個面的邊緣會發(fā)生截斷，為確保在整個視場（FOV）內(nèi)均勻傳輸，將多邊形掃描的填充率設置為70%。采用42度峰-峰光學掃描角，能夠?qū)崿F(xiàn)3.23mm的線性掃描場。

該多邊形掃描儀的旋轉(zhuǎn)速度范圍為7000-30000轉(zhuǎn)/分鐘（RPM），對應的線率為1.4kHz-6kHz。不同制造商還可提供更高轉(zhuǎn)速的多邊形掃描儀，如55000RPM，可能進一步提高掃描速度到11kHz線率。

遠程聚焦模塊
遠程聚焦模塊用于調(diào)節(jié)2P焦平面與3P焦平面之間的距離。在2P光束路徑中，光線依次經(jīng)過HWP和PBS，然后被引導到一個季度波片（QWP）和遠程聚焦物鏡（ROBJ）上。

QWP和ROBJ在經(jīng)過一個小鏡子（PF03-03-P01）和一個定制適配器（約20g總重量）反射后實現(xiàn)雙程通過，且ROBJ的后孔徑與成像物鏡的后孔徑共軛。該模塊可實現(xiàn)不同焦平面位置的軸向分辨率調(diào)節(jié)。

4、信號采集
熒光和三次諧波產(chǎn)生（THG）信號通過成像物鏡收集，然后立即被一個77mm×108mm的二向色分束器反射到一個定制設計的檢測系統(tǒng)，以實現(xiàn)高收集效率。

另一個77mm×108mm的二向色鏡將信號進一步分為兩個通道：一個用于收集來自GCaMP6s的熒光信號，另一個用于收集THG信號。分別使用特定的一英寸光學濾波器520/70和 435/40對兩個通道進行濾波。

信號最終由兩個有效傳感器面積為的GaAsP光電倍增管進行檢測，該光電倍增管經(jīng)過定制，去除了內(nèi)置前置放大單元，以降低暗計數(shù)。在成像深度為900μm時，對3.5mm FOV的熒光成像檢測效率約為3.5%，此檢測效率是通過既定的經(jīng)驗模型計算得出，該模型基于大腦表面的熒光分布以及相關(guān)測量結(jié)果。
 

自適應激發(fā)和光束掃描方案
1、自適應激發(fā)
首先通過常規(guī)光柵掃描獲取結(jié)構(gòu)圖像，然后利用高斯濾波器和中值濾波器去除圖像中的尖銳特征。接著，選擇結(jié)構(gòu)圖像中像素強度排名前80%的區(qū)域作為成像區(qū)域，通過這種方式有效地排除了血管陰影區(qū)域。

將選定的成像區(qū)域位置轉(zhuǎn)換為數(shù)字時間序列，針對每個掃描線分別進行轉(zhuǎn)換。然后將這些時間序列發(fā)送到任意波形發(fā)生器（AWG）。AWG由ScanImage的線觸發(fā)信號觸發(fā)，它控制普克爾斯盒），使得激光功率僅傳輸?shù)揭晥鲋羞x定的區(qū)域。

對于3PM，使用一個AWG實現(xiàn)自適應激發(fā)。而對于2P/3P復用的情況，則需要使用兩個AWG（PXI-5421和PXI-5412,National Instrument），以適應不同成像深度下的不同選定區(qū)域AWG的采樣率設置為5MHz。

2、光束掃描
采用點擴散函數(shù)（PSF）優(yōu)化的光束掃描方案，通過調(diào)整DEEPscope物鏡的后孔徑填充率來實現(xiàn)特定的數(shù)值孔徑（NA）。具體而言，將后孔徑以約85%填充（使用激發(fā)光束的半徑），得到NA約為0.58，從而在整個視場（FOV）內(nèi)實現(xiàn)軸向分辨率約為5μm（全寬半高，F(xiàn)WHM）以及橫向分辨率約為0.7μm。

與軸向分辨率為2μm的PSF相比，在相同目標注量下，這種優(yōu)化后的PSF能夠使熒光信號提高約4倍，同時檢測保真度指標（d’）提高約一倍。此外，還創(chuàng)建了一種雙光束掃描方案，即兩個具有5μm軸向分辨率的PSF在相鄰兩行進行掃描，時間延遲約為20ns。這種雙光束掃描方案與軸向分辨率為10μm的PSF掃描相比，能夠進一步提高d’值約10%（同時熒光信號提高約20%），并且在相同目標注量下，兩者所需功率相同。而且，雙光束掃描方案使有效激光重復率和線掃描速度翻倍，從而提高了空間和時間分辨率。

實驗結(jié)果
1、大視場成像
DEEPscope在散射組織中成功實現(xiàn)了直徑3.5mm的大視場單細胞分辨率成像。其實驗裝置利用2P和3P激發(fā)，3P激發(fā)路徑包括自適應激發(fā)模塊、光束生成延遲線和多邊形掃描儀的掃描引擎，2P激發(fā)路徑包括自適應激發(fā)模塊、遠程聚焦模塊和與3P共用的多邊形掃描引擎。

多邊形掃描儀在該顯微鏡中發(fā)揮了關(guān)鍵作用，它實現(xiàn)了大掃描角度和高速掃描。與現(xiàn)有LFOV顯微鏡相比，它降低了掃描引擎的復雜性。同時，其光學路徑和占地面積（約3ft×3ft×1ft）與傳統(tǒng)多光子顯微鏡相近，但具有更大的孔徑（9.5mm）和更寬的光學掃描角度（約42度峰-峰，在70%占空比下），其多邊形線率（約6kHz）是相同光學掃描角度下5-mm孔徑振鏡掃描儀（<1kHz）的6倍以上。

2、提高多光子激發(fā)效率
自適應激發(fā)
優(yōu)化的PSF和光束掃描方案顯著提高了激發(fā)效率。對于優(yōu)化的 d’，通過調(diào)整DEEPscope物鏡的后孔徑填充率，實現(xiàn)了數(shù)值孔徑約為0.58的PSF，其尺寸接近神經(jīng)元細胞體的最佳尺寸。與軸向分辨率為2μm的PSF相比，在相同目標注量下，該PSF使熒光信號提高約4倍，d’值提高約一倍。

光束掃描
進一步的雙光束掃描方案，即兩個具有5μm軸向分辨率的PSF進行掃描，與軸向分辨率為10μm的PSF掃描相比，進一步提高了d’值約10%（同時熒光信號提高約20%），并且使有效激光重復率和線掃描速度翻倍，從而提高了空間和時間分辨率。

在LFOV 2P和3P成像過程中，自適應激發(fā)方案通過在大血管陰影區(qū)域阻擋激光，有效地提高了感興趣區(qū)域的有效功率。以皮質(zhì)層6（L6）成像為例，在自適應激發(fā)時，熒光強度（以灰度級強度表示）增加。這是因為自適應激發(fā)時，感興趣區(qū)域的有效功率從非自適應激發(fā)的130mW提高到224mW，而大腦表面的平均功率在自適應激發(fā)情況下低于非自適應激發(fā)情況。

3、單細胞分辨率的3P成像
結(jié)構(gòu)成像
在轉(zhuǎn)基因小鼠的皮質(zhì)柱和海馬CA1區(qū)域的錐體細胞層（SP）進行了3P LFOV結(jié)構(gòu)成像。掃描區(qū)域為3.23mm×3.23mm，能夠覆蓋顯微鏡3.5mm直徑FOV的大部分。在從100到1048μm 深度的堆棧成像中，觀察到SP層表達GCaMP6s的神經(jīng)元在約872μm深度出現(xiàn)，外部囊泡（EC）的髓鞘軸突產(chǎn)生的THG信號在視場中彎曲延伸，其范圍從大腦表面下約600μm到 1048μm。

成像后，通過數(shù)字放大的圖像和視頻可以清晰看到整個皮質(zhì)柱和皮層下區(qū)域標記的神經(jīng)元。在血管標記的小鼠中，在大腦表面下800μm深度處測量得到軸向分辨率約為5μm，這為視場中某一特定位置的軸向分辨率提供了估計值。雖然未進行全面測量，但推測在深層組織成像時，軸向分辨率可能在整個LFOV內(nèi)有所變化。

活動成像
記錄了皮質(zhì)L6中表達GCaMP6s的神經(jīng)元的自發(fā)活動，展示了3P DEEPscope在深層皮質(zhì)區(qū)域進行LFOV活動成像的能力。掃描區(qū)域為3.23mm×3.23mm，在600μm深度處（正好位于EC 上方）記錄了大量神經(jīng)元（917個）的活動軌跡。

掃描幀率為4Hz，這是由多邊形掃描儀和兩個光束實現(xiàn)的，使其掃描吞吐量與成像視場相匹配。然而，由于激光重復率的限制，有效幀率為2.6Hz（即每個像素每秒約被2.6個脈沖照射）。記錄期間，平均每個神經(jīng)元每秒約58個光子，對應d’約為2.3，低于常規(guī)3P成像在相同轉(zhuǎn)基因小鼠中的d’值（約3）。

同時，還對海馬SP神經(jīng)元在930μm深度進行了成像，由于激光平均功率限制以防止組織加熱，視場縮小為550μm×550μm，并記錄了503個識別出的海馬SP神經(jīng)元中最活躍的42個神經(jīng)元的熒光時間軌跡。

4、2P和3P雙激發(fā)成像
不同深度的成像能力
設計的DEEPscope適用于910-930nm、1030-1050nm、1240-1380nm和1640-1750nm的激發(fā)波長，能夠?qū)崿F(xiàn)2P淺成像和3P深成像。對成年轉(zhuǎn)基因小鼠腦表面下480μm的L5神經(jīng)元進行成像，在不同視場和幀率下記錄了大量神經(jīng)元的活動軌跡，展示了2P成像的能力。

例如，在一種情況下，通過減少視場到3.23mm×1mm，實現(xiàn)了高空間分辨率活動成像（0.67μm像素尺寸），掃描幀率為 4Hz，此時可以清晰看到標記神經(jīng)元的核排除和樹突。在另一種情況下，記錄了2000個神經(jīng)元的活動軌跡，幀率為6Hz。

同時成像
同時進行了2P和3P活動成像，對成年轉(zhuǎn)基因小鼠淺層和深層皮質(zhì)表達GCaMP6s的神經(jīng)元進行了六平面成像。在2P成像方面，以3.23mm×3.23mm FOV對五個焦平面在320、340、360、370、380、400μm深度進行成像，循環(huán)速率為2.2Hz；在3P 成像方面，在600μm深度進行成像，掃描幀率為11Hz。通過這種方式，能夠在清醒條件下記錄大量神經(jīng)元（4523個）的活動軌跡。

5、成年斑馬魚腦的3P大視場成像
對成年斑馬魚腦進行了3P LFOV成像，從0到1090μm深度的堆棧中，在端腦、視頂蓋和小腦區(qū)域可以清晰看到表達GCaMP6s的細胞核，THG信號顯示了骨結(jié)構(gòu)和纖維束，還能看到整個嗅球、嗅神經(jīng)和部分嗅上皮。

結(jié)論與展望
DEEPscope為多光子顯微鏡在LFOV、深層和高分辨率成像方面提供了一種非常有前景的解決方案。其采用的多邊形-振鏡掃描儀大大降低了LFOV多光子成像系統(tǒng)的復雜性，使得成像系統(tǒng)更加簡潔高效。

光束掃描和自適應激發(fā)方案具有模塊化、可擴展的特點，能夠很容易地集成到典型的多光子顯微鏡中，為現(xiàn)有顯微鏡的升級提供了可能。

DEEPscope不僅突破了傳統(tǒng)多光子顯微鏡在視野和深度上的限制，還為大腦神經(jīng)回路的系統(tǒng)研究提供了強而有力的工具。該設備所展示的技術(shù)可以輕松集成到現(xiàn)有的多光子顯微鏡中，使其能夠廣泛應用于神經(jīng)科學及其他需要高分辨率深度組織成像的領(lǐng)域。該設備有望在神經(jīng)科學領(lǐng)域的系統(tǒng)性疾病研究中，推動腦科學研究邁向新的高度，改變我們對大腦復雜網(wǎng)絡及其在健康和疾病中的理解。

聲明：本文僅用作學術(shù)目的。文章來源于：Mok, A.T., Wang, T., Zhao, S. et al. A large field-of-view, single-cell-resolution two- and three-photon microscope for deep and wide imaging. eLight 4, 20 (2024). https://doi.org/10.1186/s43593-024-00076-4