外源ACO基因調(diào)控番茄成熟的基因?qū)用嫜芯?/b>

一、引言
番茄（Solanum lycopersicum）作為世界上廣泛種植和消費(fèi)的重要蔬菜作物之一，其成熟過程是一個(gè)復(fù)雜且受到嚴(yán)格調(diào)控的生理過程。果實(shí)的成熟不僅影響其外觀、口感和風(fēng)味，還對(duì)其營養(yǎng)價(jià)值和市場(chǎng)價(jià)值有著至關(guān)重要的作用。乙烯作為一種關(guān)鍵的植物激素，在番茄成熟過程中扮演著核心角色，它啟動(dòng)和調(diào)控了一系列與成熟相關(guān)的生理生化變化。
1 - 氨基環(huán)丙烷 - 1 - 羧酸氧化酶（ACO）是乙烯生物合成途徑中的關(guān)鍵限速酶，其活性直接影響乙烯的生成量。在番茄中，內(nèi)源 ACO 基因在果實(shí)成熟過程中的表達(dá)變化已被廣泛研究，但外源 ACO 基因?qū)�入番茄后如何在基因�(qū)用嬲{(diào)控番茄成熟仍存在許多未知。通過將外源 ACO 基因引入番茄基因組，我們可以深入探究其對(duì)番茄成熟相關(guān)基因表達(dá)的影響，進(jìn)而揭示新的成熟調(diào)控機(jī)制，這對(duì)于番茄品質(zhì)改良和采后處理等方面具有重要意義。

二、材料與方法
（一）植物材料
選用商業(yè)品種的番茄種子，經(jīng)消毒處理后，在溫室中培養(yǎng)至幼苗階段。選取生長(zhǎng)狀態(tài)一致、健康的幼苗用于后續(xù)的遺傳轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。
（二）外源 ACO 基因的獲取
基因克隆
從含有目標(biāo) ACO 基因的供體生物（如其他植物物種或微生物）中提取總基因組 DNA。根據(jù)已公布的 ACO 基因序列設(shè)計(jì)特異性引物，通過聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）擴(kuò)增獲得目的基因片段。PCR 反應(yīng)體系包括模板 DNA、dNTPs、引物、Taq DNA 聚合酶和緩沖液等，反應(yīng)條件經(jīng)過優(yōu)化，包括變性溫度、退火溫度和延伸時(shí)間等參數(shù)，以確保獲得高質(zhì)量的目的基因片段。
基因序列分析
對(duì)克隆得到的外源 ACO 基因片段進(jìn)行測(cè)序分析，將測(cè)序結(jié)果與已知的 ACO 基因序列進(jìn)行比對(duì)，確認(rèn)其序列的準(zhǔn)確性和完整性。同時(shí)，利用生物信息學(xué)工具分析該基因的編碼區(qū)、啟動(dòng)子區(qū)域、可能的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)等信息，為后續(xù)研究提供理論依據(jù)。
（三）植物表達(dá)載體的構(gòu)建
載體選擇
選擇適合番茄遺傳轉(zhuǎn)化的雙元載體，如 pBI121 等，該載體含有 CaMV 35S 啟動(dòng)子等元件，能夠在植物細(xì)胞中高效表達(dá)外源基因。
基因連接與轉(zhuǎn)化
將經(jīng)過酶切和純化處理的外源 ACO 基因片段與同樣經(jīng)過酶切處理的植物表達(dá)載體進(jìn)行連接。連接反應(yīng)使用 T4 DNA 連接酶，在合適的緩沖液和溫度條件下進(jìn)行。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞（如 DH5α）中，通過含有相應(yīng)抗生素（如卡那霉素）的 LB 平板篩選陽性克隆。對(duì)陽性克隆進(jìn)行質(zhì)粒提取和酶切驗(yàn)證，確保外源 ACO 基因正確插入到植物表達(dá)載體中。
（四）番茄的遺傳轉(zhuǎn)化
農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化
將含有外源 ACO 基因植物表達(dá)載體的農(nóng)桿菌菌株（如 LBA4404）培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，收集菌體，用侵染緩沖液重懸。將番茄幼苗的子葉或下胚軸切段作為外植體，浸泡在農(nóng)桿菌菌液中進(jìn)行侵染。侵染后的外植體在共培養(yǎng)培養(yǎng)基上培養(yǎng)一段時(shí)間（如 2 - 3 天），然后轉(zhuǎn)移至含有篩選抗生素（如卡那霉素）和抑菌劑（如頭孢霉素）的選擇培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選培養(yǎng)。定期更換培養(yǎng)基，直至再生出抗性芽。
抗性植株的篩選與鑒定
將在選擇培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的抗性芽轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基中，使其生根形成完整植株。對(duì)再生植株進(jìn)行 PCR 檢測(cè)，使用針對(duì)外源 ACO 基因的特異性引物，以確定外源基因是否成功整合到番茄基因組中。同時(shí)，通過 Southern blotting 雜交進(jìn)一步驗(yàn)證外源基因的整合情況，包括整合的拷貝數(shù)等信息。
（五）基因表達(dá)分析
RNA 提取與 cDNA 合成
在番茄果實(shí)不同發(fā)育階段（綠熟期、轉(zhuǎn)色期、成熟期等），分別從轉(zhuǎn)基因番茄和野生型番茄中提取總 RNA。使用 TRIzol 試劑或其他適合的 RNA 提取方法，確保提取的 RNA 純度高、完整性好。然后，利用反轉(zhuǎn)錄酶將提取的 RNA 反轉(zhuǎn)錄為 cDNA，用于后續(xù)的基因表達(dá)分析。
實(shí)時(shí)熒光定量 PCR（qRT - PCR）分析
根據(jù)番茄成熟相關(guān)基因（包括乙烯合成途徑基因如 ACS、乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)基因如 ETR、果實(shí)軟化相關(guān)基因如 PG 等）和外源 ACO 基因的序列設(shè)計(jì)特異性引物。以 cDNA 為模板，使用 SYBR Green 或 TaqMan 熒光定量 PCR 試劑進(jìn)行 qRT - PCR 分析。通過比較轉(zhuǎn)基因番茄和野生型番茄中各基因的相對(duì)表達(dá)量，分析外源 ACO 基因?qū)Τ墒煜嚓P(guān)基因表達(dá)的影響。每個(gè)樣本設(shè)置 3 個(gè)重復(fù)，采用 2 - ΔΔCT 方法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。
基因芯片分析（可選）
為了更全面地了解外源 ACO 基因?qū)�入后番茄基因表達(dá)的變化情況，可以采用基因芯片技術(shù)。提取轉(zhuǎn)基因番茄和野生型番茄果實(shí)的 RNA，標(biāo)記后與番茄全基因組芯片進(jìn)行雜交。通過對(duì)芯片數(shù)據(jù)的分析，鑒定出差異表達(dá)的基因，并進(jìn)行功能注釋和通路分析，進(jìn)一步揭示外源 ACO 基因在番茄成熟過程中的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。
（六）生理指標(biāo)測(cè)定
乙烯釋放量測(cè)定
在番茄果實(shí)發(fā)育過程中，定期采集轉(zhuǎn)基因番茄和野生型番茄果實(shí)，將果實(shí)置于密封容器中，在一定溫度下（如 25℃）放置一段時(shí)間（如 1 - 2 小時(shí)）。然后，使用氣相色譜儀測(cè)定容器內(nèi)乙烯的濃度，根據(jù)果實(shí)重量和放置時(shí)間計(jì)算乙烯釋放量，以評(píng)估外源 ACO 基因?qū)σ蚁┖铣傻挠绊憽?br /> 果實(shí)硬度測(cè)定
使用果實(shí)硬度計(jì)在番茄果實(shí)不同部位測(cè)量果實(shí)硬度。在果實(shí)發(fā)育的各個(gè)階段，對(duì)轉(zhuǎn)基因番茄和野生型番茄進(jìn)行硬度測(cè)定，分析外源 ACO 基因?qū)�果�?shí)軟化過程的影響。
果實(shí)色澤和成分分析
通過色差計(jì)測(cè)量番茄果實(shí)的色澤參數(shù)（如 L*、a*、b * 值），評(píng)估果實(shí)的外觀變化。同時(shí)，采用高效液相色譜（HPLC）等方法分析果實(shí)中的糖、酸、維生素 C 等成分含量，以全面了解外源 ACO 基因?qū)Ψ�茄果�?shí)品質(zhì)的影響。

三、結(jié)果
（一）外源 ACO 基因的克隆與序列分析
成功從供體生物中克隆出外源 ACO 基因片段，測(cè)序結(jié)果表明其與已知的 ACO 基因序列具有高度同源性。生物信息學(xué)分析顯示該基因具有典型的 ACO 基因結(jié)構(gòu)特征，包括保守的氨基酸序列和可能的活性位點(diǎn)。
（二）植物表達(dá)載體的構(gòu)建與驗(yàn)證
構(gòu)建的植物表達(dá)載體經(jīng)酶切驗(yàn)證和測(cè)序分析，證實(shí)外源 ACO 基因已正確插入到載體中，并且載體上的其他元件（如啟動(dòng)子、終止子等）完整無損，為后續(xù)的遺傳轉(zhuǎn)化提供了合適的載體。
（三）番茄的遺傳轉(zhuǎn)化與鑒定
通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化，獲得了一批具有卡那霉素抗性的番茄再生植株。PCR 和 Southern blotting 結(jié)果表明，外源 ACO 基因已成功整合到部分番茄植株的基因組中，且不同植株中外源基因的整合拷貝數(shù)存在差異。
（四）基因表達(dá)分析結(jié)果
qRT - PCR 分析
在轉(zhuǎn)基因番茄果實(shí)中，外源 ACO 基因在果實(shí)發(fā)育過程中呈現(xiàn)出特定的表達(dá)模式。與野生型番茄相比，轉(zhuǎn)基因番茄中乙烯合成途徑基因 ACS 的表達(dá)在轉(zhuǎn)色期和成熟期顯著上調(diào)，表明外源 ACO 基因的導(dǎo)入增強(qiáng)了乙烯合成的上游調(diào)控。同時(shí)，乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)基因 ETR 的表達(dá)也發(fā)生了變化，在成熟期表達(dá)量增加，暗示乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)受到影響。果實(shí)軟化相關(guān)基因 PG 在轉(zhuǎn)基因番茄中的表達(dá)提前且表達(dá)量增加，說明外源 ACO 基因加速了果實(shí)軟化進(jìn)程。
基因芯片分析（若進(jìn)行）
基因芯片分析結(jié)果顯示，除了上述已知的成熟相關(guān)基因外，還有大量其他基因的表達(dá)在轉(zhuǎn)基因番茄和野生型番茄之間存在差異。這些差異表達(dá)基因涉及到多個(gè)生物學(xué)過程，包括碳水化合物代謝、細(xì)胞壁合成與降解、色素合成等，進(jìn)一步表明外源 ACO 基因?qū)Ψ�茄成熟過程的廣泛影響。
（五）生理指標(biāo)測(cè)定結(jié)果
乙烯釋放量
在果實(shí)發(fā)育過程中，轉(zhuǎn)基因番茄的乙烯釋放量明顯高于野生型番茄，尤其是在轉(zhuǎn)色期和成熟期。這與基因表達(dá)分析中乙烯合成途徑基因表達(dá)上調(diào)的結(jié)果相吻合，表明外源 ACO 基因促進(jìn)了乙烯的合成。
果實(shí)硬度
隨著果實(shí)發(fā)育，轉(zhuǎn)基因番茄果實(shí)硬度下降速度比野生型番茄快。在成熟期，轉(zhuǎn)基因番茄果實(shí)硬度顯著低于野生型番茄，這與 PG 等果實(shí)軟化相關(guān)基因表達(dá)變化一致，說明外源 ACO 基因加速了果實(shí)軟化。
果實(shí)色澤和成分
轉(zhuǎn)基因番茄果實(shí)色澤變化比野生型番茄提前，表現(xiàn)為 a * 值（紅色度）增加更快。在果實(shí)成分方面，轉(zhuǎn)基因番茄果實(shí)中的可溶性糖含量在成熟期略有增加，而有機(jī)酸含量略有下降，維生素 C 含量變化不明顯，總體上改變了果實(shí)的風(fēng)味品質(zhì)。

四、討論
（一）外源 ACO 基因?qū)σ蚁┖铣赏緩降挠绊?br /> 外源 ACO 基因的導(dǎo)入增強(qiáng)了番茄果實(shí)中乙烯的合成，這主要通過上調(diào)乙烯合成途徑中的關(guān)鍵基因 ACS 的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)。ACO 作為乙烯合成的下游關(guān)鍵酶，其過量表達(dá)可能反饋調(diào)節(jié)了上游 ACS 基因的表達(dá)，從而增加了乙烯的合成量。這種乙烯合成的增加啟動(dòng)了一系列與成熟相關(guān)的生理變化，如果實(shí)軟化和色澤變化。
（二）對(duì)乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和成熟相關(guān)基因網(wǎng)絡(luò)的影響
外源 ACO 基因不僅影響了乙烯合成，還對(duì)乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)產(chǎn)生了影響。ETR 基因表達(dá)的變化表明乙烯信號(hào)感知和傳導(dǎo)過程發(fā)生了改變。同時(shí)，果實(shí)軟化相關(guān)基因 PG 等的表達(dá)變化說明外源 ACO 基因通過乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑影響了果實(shí)軟化等成熟相關(guān)過程。基因芯片分析結(jié)果進(jìn)一步揭示了外源 ACO 基因在番茄成熟過程中的復(fù)雜調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，涉及多個(gè)與果實(shí)品質(zhì)相關(guān)的生物學(xué)過程。
（三）對(duì)番茄果實(shí)品質(zhì)的影響
從生理指標(biāo)測(cè)定結(jié)果來看，外源 ACO 基因?qū)Ψ�茄果�?shí)品質(zhì)有著顯著影響。果實(shí)硬度下降和色澤變化影響了果實(shí)的外觀和口感，而果實(shí)成分的變化則改變了果實(shí)的風(fēng)味。這些結(jié)果表明，通過調(diào)控外源 ACO 基因的表達(dá)，可以在一定程度上對(duì)番茄果實(shí)品質(zhì)進(jìn)行改良，但需要進(jìn)一步優(yōu)化以平衡不同品質(zhì)性狀之間的關(guān)系。

五、結(jié)論
本研究成功將外源 ACO 基因?qū)�入番茄基因組，并系統(tǒng)地研究了其在基因?qū)用嫔蠈?duì)番茄成熟的調(diào)控機(jī)制。結(jié)果表明，外源 ACO 基因通過影響乙烯合成途徑、乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和多個(gè)成熟相關(guān)基因的表達(dá)，改變了番茄的成熟進(jìn)程和果實(shí)品質(zhì)。本研究為進(jìn)一步理解番茄成熟的分子機(jī)制提供了新的視角，同時(shí)也為利用基因工程技術(shù)改良番茄品質(zhì)提供了理論和實(shí)踐依據(jù)。未來的研究可以進(jìn)一步探索外源 ACO 基因與其他成熟調(diào)控基因之間的相互作用，以及在不同環(huán)境條件下的調(diào)控效果，以實(shí)現(xiàn)更精準(zhǔn)的番茄品質(zhì)改良。