數(shù)字PCR與基因編輯育種：番茄基因組倒位頻率檢測助力番茄育種

染色體倒位(inversion)是由于同一條染色體上發(fā)生了兩次斷裂，產(chǎn)生的片段顛倒180度后重新連接造成的。染色體倒位現(xiàn)象在植物中廣泛存在，對植物育種來說是有利又有弊。有利之處在于染色體倒位可能改變減數(shù)分裂過程中基因的重組頻率，促進物種進化，為生物育種提供了新的策略。不利之處在于倒位也可能對受精和胚胎發(fā)育過程產(chǎn)生不良影響，導(dǎo)致生育能力降低或產(chǎn)生遺傳異常的后代。

（圖源：網(wǎng)絡(luò)，侵刪）

基因編輯是在植物中誘發(fā)或者逆轉(zhuǎn)倒位突變的有效方法，為修改局部重組率提供了有效機制。最近，荷蘭瓦赫寧根大學(xué)的研究團隊在bioRxiv上發(fā)布了題為“ Key determinants of CRISPR/Cas9 induced inversions in tomato ”的文章。作者運用CRISPR/Cas9技術(shù)在番茄6號染色體上誘導(dǎo)了一系列從1 kb到37.5 Mb不等的倒位，使用數(shù)字PCR方法驗證倒位事件的發(fā)生，其結(jié)果與測序結(jié)果高度一致。本文深入探究了CRISPR/Cas9技術(shù)誘導(dǎo)染色體倒位的實驗方法和影響因素，為精準(zhǔn)育種開辟了新路徑。

應(yīng)用亮點：

• 首次系統(tǒng)地探討了CRISPR/Cas9在番茄中誘導(dǎo)基因組倒位的關(guān)鍵機制，揭示了不同因素對倒位發(fā)生頻率和類型的影響。

• 創(chuàng)新性地應(yīng)用naica®微滴芯片式數(shù)字PCR系統(tǒng)對CRISPR/Cas9誘導(dǎo)的基因組變化進行高靈敏度和定量分析，為監(jiān)測基因組編輯結(jié)果提供了更為精準(zhǔn)的工具。

實驗結(jié)果：

⒈ 倒位片段長度與倒位誘導(dǎo)頻率的關(guān)系：作者設(shè)計了十三個CRISPR/Cas9構(gòu)建體，每個構(gòu)建體含有兩個靶向番茄染色體6特定位點的gRNA，一個是固定的參考gRNA，另一個是可變gRNA。通過這些構(gòu)建體誘導(dǎo)了一系列1 kb到37.5 Mb不等的倒位，發(fā)現(xiàn)倒位大小對誘導(dǎo)頻率的影響微乎其微，除非大于1Mb的倒位。對于長片段的倒位，無論gRNA切割效率如何，其倒位頻率都會大幅地下降。作者提出了假設(shè)，長片段倒位形成的頻率較低可能是因為這些片段運輸?shù)叫迯?fù)部位的過程中，受到其尺寸的阻礙。

▲圖1，使用固定gRNA的平均突變頻率對轉(zhuǎn)染效率進行校正后得到的可變gRNA突變頻率(%)（縱坐標(biāo)）

⒉不同方法驗證：作者將CRISPR/Cas9構(gòu)建體轉(zhuǎn)染到原生質(zhì)體中，利用naica®微滴芯片式數(shù)字PCR系統(tǒng) (cdPCR)鑒定倒位事件。同時，利用Hi-Seq測序技術(shù)檢測了固定和可變gRNA靶點上雙鏈斷裂(DSB)位點的突變（1kb-3kb），進一步驗證突變和倒位事件的發(fā)生的頻率。這種雙重方法能夠?qū)⒌刮活l率與突變誘導(dǎo)頻率聯(lián)系起來。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩種檢測技術(shù)的結(jié)果高度一致，檢測的倒位頻率相當(dāng)。

▲圖2c：naica 數(shù)字PCR微滴質(zhì)控圖，藍色圈表示陽性微滴，代表倒位事件的發(fā)生

▲圖2b：通過PacBio Sequel II測序(綠色)和cdPCR (藍色) 檢測到的1kb和3kb大小的倒位事件頻率

⒊ 修復(fù)機制：作者假設(shè)了植物細(xì)胞內(nèi)可能存在一種未被完全理解的非同源末端連接（NHEJ）修復(fù)機制，利用受損染色體部分的主動運輸?shù)郊?xì)胞核中的專用修復(fù)位點來完成修復(fù)。

⒋ 倒位頻率的瓶頸：作者發(fā)現(xiàn)，可變gRNA的切割能力較低時，倒位的頻率也將下降，可變gRNA的切割能力可能是誘導(dǎo)倒位的關(guān)鍵因素。

結(jié)論：

倒位事件在細(xì)胞群體中的發(fā)生頻率通常較低，長片段（如超過1 Mb）倒位事件頻率更低。cdPCR較傳統(tǒng)PCR方法，具備更高靈敏度，使其能夠檢測到這些低頻事件。研究團隊使用cdPCR檢測到的倒位事件與PacBio Sequel II測序數(shù)據(jù)高度一致，驗證了cdPCR在倒位檢測中的可靠性。這項研究不僅增進了我們對基因編輯過程中染色體結(jié)構(gòu)變異的理解，也為植物育種提供了新的策略，通過調(diào)控倒位頻率，可以更精準(zhǔn)地改良作物特性，培育出更優(yōu)質(zhì)的番茄品種。

參考文獻：
Jillis Grubben, Gerard Bijsterbosch, Richard G.F. Visser, Henk J. Schouten. (2024). Key determinants of CRISPR/Cas9 induced inversions in tomato. bioRxiv. doi:10.1101/2024.01.09.574821