助力基因治療，賽業(yè)iPSC體外疾病模型研究平臺(tái)上線(xiàn)

瀏覽次數(shù)：1177　發(fā)布日期：2022-12-7　來(lái)源：本站　本站原創(chuàng)，轉(zhuǎn)載請(qǐng)注明出處

科研人員困惑：iPSC細(xì)胞點(diǎn)突變無(wú)純合基因型？iPSC細(xì)胞基因編輯時(shí)總是分化？iPSC細(xì)胞基因修飾后拿不到單克隆？

iPSC體外疾病模型研究平臺(tái)來(lái)幫你！

圖1 iPSC體外疾病模型研究思路

誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPSC）能再分化成特定的細(xì)胞類(lèi)型、組織和器官，聯(lián)合基因編輯技術(shù)使用，可用于探索疾病發(fā)生的機(jī)制、開(kāi)發(fā)新型有效的藥物和細(xì)胞治療等。賽業(yè)生物iPSC體外疾病模型研究平臺(tái)，擁有成熟的基因編輯技術(shù)和干細(xì)胞培養(yǎng)體系，攻克了iPS細(xì)胞培養(yǎng)難、基因編輯、單克隆化難等多方面問(wèn)題，同時(shí)結(jié)合一站式表型分析服務(wù)，可為客戶(hù)打造多種疾病應(yīng)用場(chǎng)景的體外模型構(gòu)建和檢測(cè)服務(wù)。

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01 使用iPSC體外疾病模型的優(yōu)勢(shì)

1、小鼠模型不能完全展現(xiàn)人類(lèi)疾病的表型與發(fā)生機(jī)制，使用基因編輯iPSC細(xì)胞疾病模型更能模擬人類(lèi)疾病的發(fā)生。
2、可創(chuàng)造遺傳背景單一的細(xì)胞系，減少因遺傳背景差異而導(dǎo)致的表型變異。
3、iPSC在體外可無(wú)限擴(kuò)增和定向分化，有利于大規(guī)模的藥物篩選和替代較難獲得的原代細(xì)胞系。

02 iPSC體外疾病模型服務(wù)內(nèi)容及交付標(biāo)準(zhǔn)

*額外檢測(cè)服務(wù)根據(jù)客戶(hù)需求：可提供核型、脫靶、流式、WB、luciferase、增殖、凋亡、周期、遷移/侵襲等。

03 構(gòu)建iPSC體外疾病模型的技術(shù)難點(diǎn)與解決方案

04 賽業(yè)iPSC基因修飾的技術(shù)優(yōu)勢(shì)

1、成熟基因編輯技術(shù)平臺(tái)：從體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)到體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，上萬(wàn)例成功基因編輯項(xiàng)目積累。

2、優(yōu)化升級(jí)的iPSC基因編輯體系：新升級(jí)遞送載體HDR效率達(dá)到50%，轉(zhuǎn)染效率>50%，轉(zhuǎn)染活率>80%。

3、獨(dú)創(chuàng)Smart-CRISPR™技術(shù)：全新升級(jí)的細(xì)胞基因編輯系統(tǒng)Smart-CRISPR™，輕松實(shí)現(xiàn)基因敲除、基因敲入除等多種策略，編輯效率高達(dá)90%。

4、快速交付：穩(wěn)轉(zhuǎn)株周期快至8周，基因敲除周期快至8周，敲入周期快至12周。

5、專(zhuān)業(yè)的項(xiàng)目管理：24h內(nèi)出方案，定期反饋?lái)?xiàng)目進(jìn)展，博士團(tuán)隊(duì)技術(shù)支持，詳盡的交付報(bào)告，并可根據(jù)要求提供不同克�。ḿ兒献�、雜合子和對(duì)照）細(xì)胞的交付。

05 iPSC體外疾病模型服務(wù)案例

iPSC-EGFP-KI細(xì)胞模型建立
通過(guò)CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)，在誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞iPSC中的某基因中插入EGFP熒光標(biāo)記（700bp）。如下圖所示，在外顯子E2的上下游設(shè)計(jì)sgRNA，并設(shè)計(jì)包含EGFP的Donor序列。通過(guò)RNP法將sgRNA和Donor轉(zhuǎn)染到iPSC中，經(jīng)過(guò)HDR途徑將EGFP序列插入外顯子E2序列的后段。

圖2 EGFP敲入方案設(shè)計(jì)

經(jīng)過(guò)PCR和測(cè)序鑒定，確定獲得在外顯子E2序列后插入EGFP的雜合iPSC細(xì)胞系。細(xì)胞培養(yǎng)后經(jīng)G顯帶進(jìn)行染色體核型分析，顯示染色體數(shù)為46數(shù)目正常，染色體結(jié)構(gòu)無(wú)明顯異常。通過(guò)免疫熒光染色，檢測(cè)NANOG、OCT4和SOX2三個(gè)干性標(biāo)記基因，均能檢測(cè)出陽(yáng)性信號(hào)，表明該敲入細(xì)胞具有干性。

圖3 iPS-EGFP KI瓊脂糖凝膠電泳鑒定結(jié)果
（來(lái)源：賽業(yè)生物）

注：引物設(shè)計(jì)策略為擴(kuò)增整個(gè)EGFP及其所在基因組上下游的部分序列。無(wú)插入EGFP的帶型為2430bp，成功插入EGFP的帶型應(yīng)在3213bp處出現(xiàn)條帶。結(jié)果顯示，編號(hào)1到8等8個(gè)單克隆在2430bp和3213bp處出現(xiàn)條帶，說(shuō)明這些克隆已經(jīng)成功插入EGFP，且為雜合克隆。

KI條帶5’sequence：

KI條帶3’sequence：

圖4 iPS-EGFP KI測(cè)序結(jié)果

注：KI條帶5’sequence展示序列為EGFP插入片段的5’端及其所在基因組的上游部分序列；KI條帶3’sequence為EGFP插入片段的3’端及其所在基因組的下游部分序列。測(cè)序分析KI條帶5’序列和3’序列均可與EGFP匹配且為套峰，證明克隆為EGFP插入片段的雜合子克隆。

圖5 iPS-EGFP KI核型分析（細(xì)胞培養(yǎng)后經(jīng)G顯帶進(jìn)行染色體核型分析，顯示染色體數(shù)為46數(shù)目正常，染色體結(jié)構(gòu)無(wú)明顯異常）

圖6 iPS-EGFP免疫熒光-干性檢測(cè)（通過(guò)免疫熒光染色，檢測(cè)NANOG、OCT4和SOX2三個(gè)干性標(biāo)記基因，均能檢測(cè)出陽(yáng)性信號(hào)，表明該敲入細(xì)胞具有干性）

注：通過(guò)對(duì)干細(xì)胞相關(guān)基因進(jìn)行免疫熒光檢測(cè)，數(shù)據(jù)顯示IPS經(jīng)過(guò)編輯后仍然具有干性

06 iPSC體外疾病模型應(yīng)用場(chǎng)景

帕金森病機(jī)制研究——PARK2-KO-iPSC模型的構(gòu)建

帕金森�。≒D）是一種不可治愈的神經(jīng)退行性疾病，其特征是中腦多巴胺能神經(jīng)元的進(jìn)行性喪失和隨后的紋狀體多巴胺耗竭。散發(fā)性和家族性PD發(fā)病機(jī)制多因?yàn)榫€(xiàn)粒體功能障礙和氧化應(yīng)激。其中，PARK2基因的突變（對(duì)線(xiàn)粒體功能有重要影響）會(huì)導(dǎo)致常染色體隱性家族性帕金森病。

帕金森病發(fā)病機(jī)制中帕金森功能障礙的研究，所用到的帕金森基因敲除動(dòng)物模型僅表現(xiàn)出輕微的疾病表型。而來(lái)自家族性PD患者的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPSCs）或通過(guò)基因組編輯引入的具有PARK2突變的細(xì)胞，能夠在體外研究人類(lèi)多巴胺能神經(jīng)元的帕金功能障礙。具有PARK2突變的PD患者iPSC衍生神經(jīng)元顯示氧化應(yīng)激增加、α-突觸核蛋白積累以及線(xiàn)粒體形態(tài)和功能紊亂。

圖7 PARK2-KO-iPSC模型構(gòu)建及分析^[1]

作者在WT-iPSC的基礎(chǔ)上對(duì)PARK2進(jìn)行敲除，獲得PARK2-KO-iPSC。再將WT-iPSC和PARK2-KO-iPSC分化成多巴胺能神經(jīng)元。對(duì)兩種iPSC進(jìn)行蛋白質(zhì)組變化的通路分析，發(fā)現(xiàn)PARK2 KO神經(jīng)元細(xì)胞周期調(diào)節(jié)、氧化應(yīng)激和能量代謝的紊亂。并且通過(guò)多種實(shí)驗(yàn)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)PARK2-KO神經(jīng)元的線(xiàn)粒體和形態(tài)產(chǎn)生異常、糖酵解和乳酸代謝不足、細(xì)胞增殖和存活率降低。

賽業(yè)生物還可提供干細(xì)胞治療心梗、過(guò)繼細(xì)胞免疫治療、阿爾茨海默病藥物篩選等更種體外模型應(yīng)用場(chǎng)景。

賽業(yè)生物Smart-CRISPR™基因編輯系統(tǒng)

賽業(yè)生物扎根細(xì)胞領(lǐng)域十幾年，重磅開(kāi)發(fā)的Smart-CRISPR™細(xì)胞基因編輯系統(tǒng)，通過(guò)深度的基因信息分析、優(yōu)秀的gRNA設(shè)計(jì)，以及表型預(yù)測(cè)、脫靶分析等多個(gè)方面綜合考量，可提供高效率、高成功率的基因編輯方案，為您快速定制各類(lèi)基因編輯單核細(xì)胞系/單克隆細(xì)胞株。

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https://www.cyagen.com/cn/zh-cn/cellbank-out/gene.html

參考文獻(xiàn)：
[1]Bogetofte H, Jensen P, Ryding M, et al. PARK2 Mutation Causes Metabolic Disturbances and Impaired Survival of Human iPSC-Derived Neurons. Front Cell Neurosci. 2019;13:297. Published 2019 Jul 5. doi:10.3389/fncel.2019.00297

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