Advanced-diff系列內耳類器官試劑盒

產品相關信息
 

01產品優(yōu)勢
無動物源成分，操作簡單，使用方便，誘導的內耳類器官能產生耳泡結構，在60天左右可觀察到感覺毛細胞生成。


02操作流程
 

分化第-2天
 

當人多能干細胞匯合度達到75%-80%左右開始誘導分化為內耳類器官，分化第-2天使用EB形成培養(yǎng)基誘導EB形成。分化第-1天，每孔加入100 μL EB形成培養(yǎng)基，使每孔體積為200 μL。
 

分化第0天
 

吸棄培養(yǎng)基，加入100 μL/孔基礎培養(yǎng)基1+補充劑A誘導EB分化，用排槍輕輕吹打，使EB懸浮。在37℃CO2，5%培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4天。
 

分化第4天
 

基礎培養(yǎng)基1+補充劑B混合均勻，按每孔25μl，加到96孔板中，并輕輕移液8-10次混勻，使每孔培養(yǎng)基的終體積為125μl，將96孔板放回培養(yǎng)箱，37℃，5%CO2孵育4天。
 

分化第8天
 

基礎培養(yǎng)基1+補充劑C混合均勻，按每孔25 μL，加到96孔板中，并輕輕移液8-10次混勻，使每孔培養(yǎng)基的終體積為150 μL，將96孔板放回培養(yǎng)箱，37℃，5%CO2孵育4天。
 

分化第12天
 

EB誘導結束，準備好基礎培養(yǎng)基2（提前在冰上冷藏至少30min）；或者，在d11上使基礎培養(yǎng)基2存儲在4°C過夜。Matrigel提前與4℃解凍，然后加入冷的基礎培養(yǎng)基2中，反復吹打溶解Matrigel，然后再培養(yǎng)基和Matrigel混合溶液中加入補充劑D，混合均勻，加熱到rt。將96孔板中的聚集物轉移到100mm培養(yǎng)皿中，用1-2mL的DPBS洗滌聚集體2次，再用1mL的混合培養(yǎng)基洗滌1次，然后加入10ml混合培養(yǎng)基，將培養(yǎng)皿放入培養(yǎng)箱中，37℃，5%CO2 孵育3天；D15吸掉培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基，重新加入不含Matrigel的混合培養(yǎng)基，繼續(xù)孵育3天，誘導耳泡形成。
 

分化第18-60天
 

內耳類器官逐漸成熟，將培養(yǎng)基換成成熟培養(yǎng)基，開始長期培養(yǎng)，每5天換一次液，到60天左右獲得具有感覺毛細胞的成熟內耳類器官。
 

 

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