顯微鏡如何在研究中實(shí)現(xiàn)高效成像

為了一定程度提高工作效率以及確保員工安全，研究機(jī)構(gòu)會(huì)限制在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)工作的時(shí)間，因此在顯微觀察中實(shí)現(xiàn)活細(xì)胞成像自動(dòng)化以及簡(jiǎn)化任務(wù)比以往任何時(shí)候都更為重要。

那么顯微鏡如何在顯微觀察中實(shí)現(xiàn)活細(xì)胞成像自動(dòng)化以及簡(jiǎn)化任務(wù)，從而讓其在研究中實(shí)現(xiàn)高效成像呢？

標(biāo)本在溫暖、穩(wěn)定的環(huán)境中保持健康狀態(tài)。

活細(xì)胞成像過程中最大挑戰(zhàn)之一就是如何在溫暖舒適的培養(yǎng)箱之外確保樣品健康并能夠在顯微鏡下實(shí)現(xiàn)正常觀察。

盡管存在難度，但可以利用能夠?yàn)榧?xì)胞提供穩(wěn)定溫度、濕度和CO ₂密度的顯微鏡專用載物臺(tái)上式培養(yǎng)箱或封閉式培養(yǎng)箱確保標(biāo)本環(huán)境盡可能適宜。

另外記得加熱物鏡，否則其作為寒冷的接觸源可能會(huì)損害樣品的健康。微孔板外圍區(qū)域可能存在比中心區(qū)域更高的環(huán)境波動(dòng)風(fēng)險(xiǎn)，因此務(wù)必使用中心區(qū)域的孔，并避免使用邊緣附近的孔影響穩(wěn)定性。比如說，如使用的是96孔板（12×8孔），那么就只使用中心的60孔（10×6孔）進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

通過創(chuàng)造穩(wěn)定的環(huán)境溫度改善聚焦效果。

另一個(gè)需要考慮的因素是室內(nèi)溫度，這是因?yàn)榧?xì)微的變化也會(huì)影響到成像性能。

顯微鏡的環(huán)境溫度穩(wěn)定性對(duì)于活細(xì)胞的高倍率觀察尤其重要。由于高數(shù)值孔徑觀察的景深較淺，因此即使溫度變化造成很小的Z漂移，系統(tǒng)也可能會(huì)因此離焦。

為了優(yōu)化環(huán)境條件，開始實(shí)驗(yàn)之前請(qǐng)確保打開您的空調(diào)并保持室溫穩(wěn)定。另外為了提高穩(wěn)定性，還要避免氣流從空調(diào)直接吹向顯微鏡。

通過精確設(shè)置焦點(diǎn)和校正環(huán)提高圖像質(zhì)量。

解決諸如Z漂移之類時(shí)間性波動(dòng)的另一種方法是開始活細(xì)胞實(shí)驗(yàn)前盡可能精確設(shè)置焦點(diǎn)和環(huán)校正。

研究人員往往只會(huì)細(xì)心調(diào)整焦點(diǎn)，而忽略了校正環(huán)。然而，校正環(huán)能夠顯著改善圖像的質(zhì)量，在進(jìn)行深層組織觀察或使用高數(shù)值孔徑物鏡時(shí)尤其如此。

校正環(huán)的理想位置取決于諸如樣品折射率、觀察平面深度和蓋玻片厚度等許多因素。即便大多數(shù)蓋玻片和玻璃底培養(yǎng)皿的厚度只有170 μm（＃1.5），其仍然會(huì)導(dǎo)致波動(dòng)，并且更重要的是，我們不能以塑料培養(yǎng)皿推測(cè)這些值。

因此，務(wù)必通過檢查圖像對(duì)比度的方式對(duì)校正環(huán)進(jìn)行精確調(diào)整，尤其是在使用塑料微孔板或培養(yǎng)皿時(shí)更要如此。

通常情況下，環(huán)校正必須要在現(xiàn)場(chǎng)進(jìn)行調(diào)整。對(duì)于諸如使用多光子顯微鏡進(jìn)行深層觀察等需要主動(dòng)調(diào)整環(huán)校正的實(shí)驗(yàn)，這可能意味著需要在實(shí)驗(yàn)室中花費(fèi)更多的時(shí)間。不過我們可以選擇使用電動(dòng)校正環(huán)自動(dòng)執(zhí)行這些調(diào)整。

使用專用聚焦模塊讓樣品保持聚焦。

可是如果發(fā)生Z漂移怎么辦？

即使完成上述所有操作，您的圖像也可能無法始終保持對(duì)焦。畢竟，很多因素都會(huì)造成Z漂移。其既可能因諸如添加試劑等主動(dòng)和有益改變所致，也可能由于有人在室內(nèi)行走或環(huán)境溫度變化造成的物理振動(dòng)引起。

盡管大多數(shù)電動(dòng)顯微鏡均具備基于圖像對(duì)比度的自動(dòng)對(duì)焦功能，但仍然有其局限性：

• 調(diào)整范圍有限
• 基于對(duì)比度聚焦的激發(fā)光會(huì)造成光毒性

確保在活細(xì)胞實(shí)驗(yàn)過程保持對(duì)焦的一種方法是使用專用聚焦模塊，比如TruFocus基于近紅外（NIR）激光的Z漂移補(bǔ)償器。近紅外光還可在長(zhǎng)時(shí)間觀察過程中盡可能地降低光毒性以及成像波長(zhǎng)的串?dāng)_。

該模塊的單次自動(dòng)對(duì)焦（AF）模式可預(yù)防不必要的照明，而連續(xù)自動(dòng)對(duì)焦模式可用于實(shí)時(shí)觀察或快速現(xiàn)象的連續(xù)圖像采集。

高效的工作始終是我們追求的目標(biāo)，所以顯微鏡的一些使用技巧可以幫助我們保持高效多產(chǎn)，實(shí)現(xiàn)更長(zhǎng)時(shí)間的活細(xì)胞成像，使得科研工作更上一層樓。