做好免疫組化染色必須注意的問題
一、為達到免疫組織化學技術的要求，組織固定越新鮮越好。
在免疫組化最后結果的判斷時，常可見到均勻一片的似非特異性染色的現(xiàn)象，經(jīng)多方研究認為，它是一種假性非特異性的染色。因為腫瘤組織中含有的抗原較易發(fā)生擴散彌散，腫瘤細胞無限制的生長和生長過速，導致腫瘤中間部分組織血液供給困難，造成缺血壞死，壞死細胞中的抗原由于機體的作用，可以被均勻地散布于細胞與細胞間的間質，這是抗原發(fā)生彌散的一種方式。另一種抗原彌散的方式就是，由于組織沒有及時的固定所引起的。離體的組織不及時固定，組織就會自溶，抗原就會擴散，這是一非常普通的常識，但要做好卻是極不容易。標本從外科切除到浸入固定液需要經(jīng)過一段時間，在這段時間里，有的抗原就可以發(fā)生擴散。雖然已浸入了固定液，但標本較大，固定液的量又不足，當然由于固定液的滲透需要時間，當滲入到組織之中時，中間的細胞已發(fā)生了變化，抗原也隨著發(fā)生擴散，這種現(xiàn)象在產(chǎn)酶多的器官是比較明顯的，如胃癌，當切除后標本較大，雖然在手術室期間已放入了固定液，但固定液要透過肌層達到胃粘膜面起碼需要幾個小時的時間，當固定液發(fā)揮作用時，組織已經(jīng)發(fā)生變化。因此，這了達到免疫組織化學染色的要求，對于離體的組織盡量快的進行固定，有條件的應將其剖開，早取材，早固定。
二、組織脫水必須徹底干凈
組織塊取材不能太大過厚，才能較好地完成脫水的過程。如果取材太厚，在較短的時間內脫水不完全，將可引起一系列的問題，比如浸蠟不徹底，切片不好完成，切不完整。由于先天不足，導致后來切片染色的脫落，造成染色的失敗，或者由此反復操作，造成年人力物力的浪費，造成病理報告的延期發(fā)出等。因此，對取材的要求是除了要求要有藝術性外，即平整、外觀好看，還要求適中。
三、切片必須完整、均勻、平展、無鄒折
應用于免疫組織化學染色的切片，對切片的質量要求較高，切片必須完整，平展、無汽泡，無鄒折，這樣有利在染色時的沖洗，有利于切片的牢固附貼。如果切片不平展，免疫組化染色后，可出現(xiàn)染色不均勻的現(xiàn)象，顏色深淺不一， 不平。如果切片有汽泡切片在烘烤時，由于汽泡的破裂影響了汽泡周圍的組織，在其周圍可觀察到深淺不一的染色。如果切片有鄒折，免疫組化染色后，在鄒折的地方有深淺不一的顏色，這是一種假陽性，容易引走混淆。
四、切片的附貼必須牢固，必須使用合適的粘貼劑。
免疫組織化學染色前的前期準備工作，就是必須對新的載玻片進行處理，新的載玻片表面看起來很干凈，有人認為不需要進行任何的處理，都能夠適合使用，這是一種錯誤的想法。新出廠的載玻片，表面復蓋著開一層油脂樣的物質，如果不加以處理，對切片的附貼是極為不利的。我們的做法是：新的載玻片，放于玻璃清洗液中浸泡4小時甚至過夜，然后取出，經(jīng)自來水徹底沖洗后，浸入酒精中達2小時以上，取出擦干備用或烘干也可。然后再將載玻片浸入了－氨基－三乙氧基－硅烷（3－Aminopropyl triethoxy-silane）的稀釋液（1：50用丙酮或無水乙醇稀釋都可以）中硅化10分鐘，后經(jīng)無水乙醇洗2次，烘干即可使用。
五、切片必須烘烤附貼牢固，既要經(jīng)得起抗原修復時高溫的作用而不使輕易脫片，又不至于破壞抗原。
應用于免疫組化染色的切片。由于整個過程需經(jīng)幾個階段的處理，如抗原修復時抗原修復液的沸騰且需持續(xù)十幾分鐘，PBS的反復沖洗，有的甚至于4℃冰箱中孵育達十幾小時。因此，對切片的質量要求很高，尤其是切片的附貼程度。以往有人主張切片在60℃以下烘烤30-60分鐘即可按此進行結果是切片掉片嚴重，切片松動率占100%。切片究竟烘烤多長時間才合適，既不脫片和適合各項要求，又不至于破壞抗原。幾組實驗［］診斷P173認為，切片在60℃的恒溫干燥箱中烘烤2-5小時最為合適。這是因為：抗原可耐受如此的溫度，病理科一般使用的石蠟，其熔點在60℃左右，組織浸蠟時，浸蠟箱中的溫度，一般都調在65℃左右，組織在這樣溫度中要浸泡2小時以上，才能達到徹底地浸蠟。組織中的抗原已經(jīng)受了65℃的溫度考驗，保存下來的抗原，都已具有耐熱性。另外，經(jīng)上述時間烘烤出來的切片，附貼牢固，抗原保存好，染色成功率達100%，保證了病理診斷的及時性和準確性。
特需要注意的是，不管是應用于診斷的切片還是研究用的切片，烘烤后應盡快進行染色。如果切片切完后，遲遲不進行染色，存放于室溫中或工作冰箱中，切片中的抗原將會隨著時間的延長而逐漸消失，甚至出現(xiàn)假陰性。原則上是新鮮切片，即行染色，染多少張切多少張，這樣才能盡可能的保存表達更多的抗原。
六、切片脫蠟必須干凈，否則將會影響免疫組化染色的最后結果。
蠟不溶于水，不與其它的臨床使用的抗體相融合。它只能靠特用的試劑，處理足夠的時間，才能將其除去。如果脫蠟不干凈，少許蠟存留于切片上，將會引起許多弊病，如染色不均勻，陽性物時隱時現(xiàn)，真假難辨，背景染色增加等。為了解決上述的問題，切片在染色前必須徹底脫蠟，目前用于脫蠟的試劑主要是二甲苯，因它脫蠟力強，脫蠟時間較短。較受使用者的青睞。脫蠟的時間要根據(jù)季節(jié)，室溫和試劑的新鮮謀面是在不同。如果在夏天，室溫較高，脫蠟試劑也新鮮，則脫蠟時間不需很多，3-5分鐘就已足夠。如果在冬天，室溫較低，脫蠟試劑也較陳舊，則脫蠟時間需要延長，10-20分鐘或更長�？傊�，操作時應根據(jù)不同的季節(jié)，不同的室溫，不同的試劑來決定，脫蠟的時間，原則上是要徹底，干凈，完全地脫去切片上的蠟。為了做到這一步，切片在脫蠟前的加溫將有助于完成上述的要求。比如：當天切的切片，燒烤2小時后進行染色，切片帶有溫度進行脫蠟這將可加速脫蠟的過程，如果預先切好烤好的切片，在染色前，還必須對切片進行加溫10-20分鐘，然后再行脫蠟，這樣脫蠟速度加快，效果魁偉更好。
七、必須徹底抑制內源性過氧化物酶的活性，才能降低背景的染色。
在各種組織中都含有很多的內源性過氧化物酶，尤其在紅細胞，中性粒細胞，單核細胞嗜酸性細胞，出血的組織壞死的組織等等。含有這種酶的各細胞和組織如果在染色前不對其進行處理和抑制，它們將會在DAB底物的顯色時，與HRP一樣催化底樣，使之顯色，使之生成與陽性物一樣的黃棕色，造成混亂。為止，在免疫組化染色前，都必須對內源性過氧化物酶進行抑制。當然，對它們進行徹底的消除是不行的，因為抑制太厲害，對抗原也會有相同的抑制作用。氫在抑制內源性過氧化物酶時，也要注意對抗原的保護抑制也只能對它們中的大部分在DAB顯色后，顯示出淡黃*色，這就足以與真正陽性物的區(qū)別。抑制劑常用的是0.3%的H2O2，也可將其稱為1%H2O2，因為市售的H2O2的濃度為30%，按其凈含量則為0.3%，如果按其溶液的用量則為1%。
關于H2O2的使用，有的使用是單純的H2O2稀釋溶，有的使用是H2O2甲醇混合 物。根據(jù)實驗，認為H2O2甲醇較適合于大多數(shù)的情況，因為除了H2O2外，甲醇對各種酶，都有鈍化的作用，因此H2O2甲醇的雙重作用效果較好。陳尚平等認為在多數(shù)情況中，用甲醇H2O2已經(jīng)獲得令人滿意的結果。
八、須適當合理地使用封閉試劑
為了減少背景產(chǎn)生的非特異性染色，在免疫組化染色的過程中，在加入一抗孵育前，常常加入非免疫動物血清，以減少背景的染色，陳尚季等認為：抗體是高度的電荷分子，可能與帶有相應電荷的組織成分無特異性地結合（如膠原）。由于這種非特異性結合，將導致標記的部分局部化（軛合物）和膠原的假陽性染色。要用一種不相干的抗體居先處理，可能減少和標記的抗體無特異性結合。
以往，血清的使用有很多，如：小牛血清，馬血清，山羊血清，綿羊血清，兔血清，濃度也有很多種，如：1%.2%.或1：5、1：10、和1:20.
必須選擇合適的抗體以及對作適當?shù)谋４婧团渲啤?br>
九、選擇合適的抗體
至今為止，應用于臨床的常用抗體有幾十種，在這當中又可分為兩種類型。
1.濃縮型抗體
根據(jù)近幾年來使用的情況認為，它有許多優(yōu)點，但也有許多不足之處：
①可作為各種疾病檢測的常備抗體。在各單位的常規(guī)活檢診斷中，有常見的病例，也有罕見的病例，尤其是后者，有時很長時間才遇到一例，這就給抗體的應用和備用提出了更高的要求，如除了常用的抗體外，還需備用一些較為罕見病例的抗體。這樣才能解決臨床的診斷問題，如臨時購買，則需較長的時間，這樣就會延誤診斷。實踐證明：濃縮型抗體，可作為常備檢測抗體。當購買抗體后，根據(jù)檢測病例的數(shù)量，在無菌的條件下，將抗體分成小包裝，然后用蠟膜封起來，于－30℃的低溫冰箱中保存，臨用時取出一支，用指溫促其回升至室溫，然后用PBS稀釋即可使用，這種抗體可保存3年左右。
②成本低，價格較便宜。
它與即用型的抗體相比較，價格要便宜好多，如以某公司2002年-2003年的CK為例，濃縮型的抗體0.1ml，價格260元，該抗體可稀釋為5000ml，以每張切片所需抗體為50ul計，可標記100例，每例一抗體所需2.6元，而即用型抗體1.5ml，價格150元，可標記30例，每例一抗體需5元。
③需要稀釋抗體，手續(xù)較為復雜�！ τ谛沦徣氲臐饪s型的抗體，使用時必須將稀釋為工作液，才能使用，對于從未用過的抗體，還必須實驗其實際的稀釋度，因為各種抗體，廠家都做了相應的稀釋度的實驗，但這是大概的稀釋度，要使抗體真正適合于本單位的稀釋度，就必須對抗體的稀釋度進行實驗，如1:100.1:75.1:50.1:25等，如果結果在1：50上是最佳結果，這就是最佳的稀釋點，如果在這范圍內找不出最佳稀釋點，則應繼續(xù)實驗直到找出最佳稀釋點為止。
④需要配置各型號的微量加樣器，以利于量取精確的抗體量。
⑤需要具備一定的英語水平，因為濃縮型的抗體多為進口試劑，其使用書都以英文為主，其中涉入抗體的來源，適應讓稀釋對什么組織或細胞可起反應等。
2.即用型抗體。
近幾年來，免疫組化技術應用的推廣，即用型抗體的應用越來越受到人們的歡迎，根據(jù)幾年來的使用，認為它有許多優(yōu)點和不足：
①使用方便。對于初學者來說，它是一種最好的抗體，不管什么樣的病例和切片，只要有抗體，不需要自己摸索稀釋度，拿起試劑瓶一滴即可，極不方便。
②對于不具備或基本不懂免疫組化技術的人，只要按照說明書的方法使用，也能獲得理想的結果。
③不需要配置多種昂貴的微量加樣器�，F(xiàn)今的微量加樣器，如為進口貨，貴者多達兩千多元。而即用型抗體無需再行稀釋，即買即用，無需配備其余器械。
④特別適合于基層單位�；鶎訂挝唬瑹o需多大的投資，就能開展免疫組化的工作，這對于提高診斷的準確率，極有好處。
⑤價格較濃縮型抗體貴。
⑥即用型抗體不可作為常備貯存抗體。即用型抗體，一般有效期為一年。如果用量大的單位，對于3ml一個包裝的抗體，一年需要用幾支，這對抗體來說，不會造成浪費。但如果為較小的單位，一年中標記的病例較少，購買抗體時也盡量選小包裝的抗體，如1.5ml。如果碰上罕見的病例，有時一年也標記不了幾例，這樣就應采用濃縮的了。即用型的抗體，有效期為一年，但真正購買到的抗體使用期就不可能為一年，因為抗體從生產(chǎn)商到銷售商的手里，需要一定的時間，如果運氣好的話，你購買到的抗體，是剛交到銷售商的手里，那么，使用的時間可能長些，但如果在銷售商的手中滯留了一段時間，抗體的有效使用期就可能不會太長，五個月、六個月或者三個月。如果在有效的時間內不能使用完。稍為超過一些時間還可以，如果時間過長，就應當丟棄，因為會影響標記的質量。有人抱怨，剛買的抗體標記很好，后來就漸漸不好了。這是因為隨著時間的延長，抗體的活性會逐漸失去生物活性，導致了標記質量的下降。
（2） 抗體的適應癥。
在眾多的抗體中，按它們的實際使用范圍，把它們分為兩個類：
1.適合于冰凍切片，涂片，細胞培養(yǎng)片。
2.適合于石蠟切片，冰凍切片，涂片和細胞培養(yǎng)片。
（3）選擇合適的單克隆或多克隆抗體。
抗體除了分為上述的兩個類外，從其克隆的高度講，也有單克隆和多克隆之分。
1.單克隆抗體，在目前臨床常用的抗體當中，大部分都是單克隆抗體。這要歸功于生物技術的不斷提高。在早些時候，應用于臨床的抗體，大多數(shù)為多克隆抗體。
2.多克隆抗體，在臨床應用的抗體中，還有少部分的抗體為多克隆抗體。
（4）抗體的加入。
這看似很簡單的問題，如果處理不好也可導致不同的結果，如果應用自動免疫組織化學染色儀，將程序輸入即可，如為手工操作，就必須注意以下的問題：
1.當PBS沖洗完畢后，在加入抗體，如一抗，二抗或三抗。必須將存留于切片上的多余的PBS摔干，但不能讓切片干涸，切片干涸，往往可產(chǎn)生非特異性染色，切片上PBS存留過多，將會稀釋加入的抗體，影響加入抗體的濃度，同時也將影響最后的結果，如假陰性等。
2.加入的抗體以一滴為佳。
當擦干組織塊周邊多余的PBS后，切片保持著一定的濕潤度，此時加入另外的抗體為最佳時候，滴入抗體以一滴50ml為好，加入后，輕微地搖勻地覆蓋于切片上，使最后的結果穩(wěn)定均衡，不至于有的地方有反應，有的地方無反應。
3.切片沒擦好將會影響加入抗體的質量，切片沒沖洗干凈，沒擦試好，當加入抗體后，它可縮于切片的一邊，此時你為了使加入的抗體能夠完全地覆蓋整個切片，便會使勁地加入抗體，此時的結果是，抗體依然滑向一邊，或者完全露出，這不光沒達到目的，還浪費抗體，正確的做法就是徹底地用PBS沖洗，摔干切片擦干切片周邊的PBS，再滴入一滴抗體輕輕搖勻即可。
（5）選擇合適的孵育時間。
第一抗體的孵育時間，有較多的使用范圍，應用于臨床檢測抗體的孵育時間。一般室溫下孵育在30-60分鐘，120分鐘，對于研究性質的抗體孵育時間，也可按照上述的時間，但也有人提出于4℃冰箱中過夜孵育，根據(jù)我們的經(jīng)驗一般不主張于4℃冰箱中過夜，原因是：
1.長時間的孵育可以使一些非特異性的物質沉淀下來，或者被吸附，造成背景的染色。
2.目前銷售的抗體，純度較高，特異性較強，不需要長時間的孵育，也能夠結合得很好 。
3.長時間的孵育，較容易引起切片的脫落，造成染色的失敗。
4.長時間的孵育，不利于臨床病理報告的發(fā)出。
十、連接抗體的選用必須正確，否則可造成假陰性的現(xiàn)象。
免疫組化染色方法較多，如ABC法，SP法和EV二步法等，如果使用的是SP法，或者ABC法，這時就必須要仔細地選擇好連接抗體，第一抗體有單克和多克隆炎分，連接抗體則要根據(jù)選用的抗體來進行，例如：第一抗體選用的是單克隆鼠抗人**抗體，連接抗體也要選擇相應的免抗鼠IgG，這樣才能連接上（目前生產(chǎn)廠家已生產(chǎn)出混合型抗體，即既適合于單克隆抗體，也適合于多克隆抗體。使用者不用擔心連接不上，隨便使用都可，但如果沒有訂購混合型的試劑盒，就必須注意的型號，使之完全適合所選用的抗體。）孵育的時間可在10分鐘，20分鐘或者30分鐘，一般在室溫中進行，如果室溫低于20℃以下，則可在37℃的孵育箱中進行。
十一、復合物的使用及孵育時間的確定。
各種方法有各自的復合物，如ABC法，復合物是卵白素和生物素結合的復合物，再帶有HRP，SP法，（LsAB法）的復合物是鏈雪菌素蛋白復合物，再帶有HRP，EV二步法的復合物則是二抗和三抗連接在一起的復合物，再帶上HRP，除此之外，根據(jù)水解底物的不同，可產(chǎn)生不同的顏色，例如：帶有HRP的酶，水解的底物一般為DAB產(chǎn)生黃棕色，帶AP的酶，水解的底物一般為AEC產(chǎn)生紅色。
十二、PBS的沖洗
免疫組化的染色過程，除了前面的處理和加入的抗體外，都在PBS的沖沖洗洗中度過，PBS沖洗的正確與否，也是導致最后結果的關鍵。
1.單獨沖洗，防止交叉反應造成污染�！�
臨床上每天檢測的病例很多，所用的抗體種類及項目也多，如果在加入一抗孵育完后，將它們在一個缸內洗，這樣就會造成交叉污染，影響最后的結果。正確的做法是單獨地進行沖洗，沖洗的PBS為一次性，保證切片沒有相互交叉污染的機會。
2.溫柔沖洗，防止切片的脫落。
沖洗切片，取出切片，將PBS從上輕輕地沖洗，讓PBS自上而下流下來，不要拿起切片將PBS對準切片沖洗，這樣由于沖出的PBS有一定的沖擊力，很容易使切片周邊引起松動，導致切片的脫落。
3.沖洗的時間要足夠，才能徹底洗去結合的物質。
沖洗切片有人提出用微振蕩器振染，振下未結合的各種物，使之不產(chǎn)生背景，此種做法一是浪費時間，二是很容易導致切片的脫落。切片的沖洗據(jù)實踐認為，用一小燒杯柔和地于切片上沖洗，就能徹底沖洗去未結合的物質，無需附加其它條件，沖洗好于切片上再注入PBS，持續(xù)2分鐘左右就完全足夠了。
4.PBS的PH和離子強度的使用和要求。
劉彥仿指出：中性及弱鹼性條件（PH7－8）有利于免疫復合物的形成，而酸性條件則有利于分解；低離子強度有利于免疫復合物的形成，而高離子強度則有利于分解。［］免疫組化P56我們目前常用的PBS的PH在7.4-7.6濃度是0.01M，根據(jù)本室十幾年來的使用情況，認為該溶液價格便宜配制方面，使用效果好。
5.常用試劑的配制和使用。
在免疫組織化學的染色過程中，用得最多的試劑就是緩沖液，因為切片在整個染色中，抗體的加，換，切片的沖洗，DAB的配制都離不開緩沖液。可見緩沖液在整個染色中都起至關鍵的作用，緩沖液的過酸或偏堿，都將影響染色的結果。下面將介紹有關方面的內容：
（1）緩沖液的配制
1.磷酸鹽緩沖液（Phosphate buffer solution.PBS）
Ⅰ液：0.2M Na H2PO4貯存液（PH7.6）
取一個具500ml的容量瓶，稱量15.60g NaH2PO4﹒12H2O倒入瓶中，加入少量蒸餾水使勁搖晃，直至溶解，加入蒸餾水湊足500ml。放于4 冰箱保存，配制時應注意的事項：
①在配制時，要先確定NaH2PO4的用量，因為該試劑有許多種類形，它們所含的水分子量不一樣，因而它們的用量也不一樣。如NaH2PO4含單個水分子時，配制時要稱取13.80g，而當含有2個水分子時，則需要稱取15.60g。
②配制時根據(jù)要求選取蒸餾水。因為蒸餾水有數(shù)種，單蒸餾水，雙蒸餾水，玻璃蒸餾水，去離子水。如沒特別要求，選用一般的蒸餾水配制則可。
③裝緩沖液的瓶子須用玻璃浸洗液泡洗過，以防污染，導致溶液中有雪菌生長。
Ⅱ液：0.2M NaHPO4貯存液(HP7.6)
取500ml的容量瓶，稱好17.91g NaHPO4﹒12H2O,倒入瓶中，邊加水邊攪拌，直至完全溶解再湊足500ml，貯存于4℃冰箱。
注意事項：
①該試劑也應注意有多種不同的含水分子量。
②該貯存液久放后可出現(xiàn)結晶。每次使用前，先取出回至室溫，搖晃其結晶溶解，也可用微波爐促其快速溶解，然后再用。
0.01M PBS工作液的配制：
取一2000ml的容量瓶一個，裝入已稱好的NaCt18g，加入少量蒸餾水讓其徹底溶解，再加入 Ⅰ液13ml，Ⅱ液87ml，加蒸餾水湊足2000ml，即可使用，即可使用該溶液在室溫下可保存3-4周，但以新配為佳。
PBS工作液配制完畢后，都要測其PH值，如果偏酸，可用氫氧化鈉來調試，如果偏堿可用HCl調試，測試有如下n種方法：
①PH測試筆測試，這是一種簡便、易行、結果較為準確的測試方法。當配制完PBS后，取一小杯，倒入配好的PBS，插入測試筆，打開開關，小屏幕上將可出現(xiàn)測出的PH結果。PH如果7.6不足，小量的可用0.2M Na2HPO4調校，大量的可用氫氧化鈉調校。PH如果高于7.6，小量的用0.2M NaH2PO4調校，大量的可用HCL來調校。
②用試紙來測試：PH試紙有兩種，一種為廣泛PH試紙，范圍在1-14，另一種是精密試紙有各種各樣的范圍。但是，作為沖洗切片用的PBS，其精確度不需要十分精確，如配PH7.6時，測試時在PH7.5或7.7，都可使用。試紙測試PH值，�？科浞磻念伾珌泶_定，十分簡便，一般的試劑都可用它來測試。
③儀器測試：對于要求較高，需較準確的PH值，須彩用儀器測試。
1.Tris緩沖溶液(Tris buffer solution,TBS)
①1N HCL ，濃HCL(雙重1.19)8.3ml，先取50ml蒸餾水，加入HCL再加水到100ml。
②0.5M Tris-HCL緩沖液(PH7.6)
取Tris(羥甲基氨基甲烷)6.57g，加入少許的蒸餾水攪拌，直至溶解，再加入1N HCL42ml，然后用蒸餾水湊足100ml，于4℃冰箱保存。
臨用時，將上述溶液10稀釋倍，即為0.05M工作液。
注意事項：
①配制1N HCL時，如果大量配制，HCL入水時可產(chǎn)生很大的熱量，對的所用的玻璃器皿應特別小心，以防突然產(chǎn)熱而使玻璃器皿爆裂。
②調校PH值時，可參考上述的三種方法
在免疫組化最后結果的判斷時，常可見到均勻一片的似非特異性染色的現(xiàn)象，經(jīng)多方研究認為，它是一種假性非特異性的染色。因為腫瘤組織中含有的抗原較易發(fā)生擴散彌散，腫瘤細胞無限制的生長和生長過速，導致腫瘤中間部分組織血液供給困難，造成缺血壞死，壞死細胞中的抗原由于機體的作用，可以被均勻地散布于細胞與細胞間的間質，這是抗原發(fā)生彌散的一種方式。另一種抗原彌散的方式就是，由于組織沒有及時的固定所引起的。離體的組織不及時固定，組織就會自溶，抗原就會擴散，這是一非常普通的常識，但要做好卻是極不容易。標本從外科切除到浸入固定液需要經(jīng)過一段時間，在這段時間里，有的抗原就可以發(fā)生擴散。雖然已浸入了固定液，但標本較大，固定液的量又不足，當然由于固定液的滲透需要時間，當滲入到組織之中時，中間的細胞已發(fā)生了變化，抗原也隨著發(fā)生擴散，這種現(xiàn)象在產(chǎn)酶多的器官是比較明顯的，如胃癌，當切除后標本較大，雖然在手術室期間已放入了固定液，但固定液要透過肌層達到胃粘膜面起碼需要幾個小時的時間，當固定液發(fā)揮作用時，組織已經(jīng)發(fā)生變化。因此，這了達到免疫組織化學染色的要求，對于離體的組織盡量快的進行固定，有條件的應將其剖開，早取材，早固定。
二、組織脫水必須徹底干凈
組織塊取材不能太大過厚，才能較好地完成脫水的過程。如果取材太厚，在較短的時間內脫水不完全，將可引起一系列的問題，比如浸蠟不徹底，切片不好完成，切不完整。由于先天不足，導致后來切片染色的脫落，造成染色的失敗，或者由此反復操作，造成年人力物力的浪費，造成病理報告的延期發(fā)出等。因此，對取材的要求是除了要求要有藝術性外，即平整、外觀好看，還要求適中。
三、切片必須完整、均勻、平展、無鄒折
應用于免疫組織化學染色的切片，對切片的質量要求較高，切片必須完整，平展、無汽泡，無鄒折，這樣有利在染色時的沖洗，有利于切片的牢固附貼。如果切片不平展，免疫組化染色后，可出現(xiàn)染色不均勻的現(xiàn)象，顏色深淺不一， 不平。如果切片有汽泡切片在烘烤時，由于汽泡的破裂影響了汽泡周圍的組織，在其周圍可觀察到深淺不一的染色。如果切片有鄒折，免疫組化染色后，在鄒折的地方有深淺不一的顏色，這是一種假陽性，容易引走混淆。
四、切片的附貼必須牢固，必須使用合適的粘貼劑。
免疫組織化學染色前的前期準備工作，就是必須對新的載玻片進行處理，新的載玻片表面看起來很干凈，有人認為不需要進行任何的處理，都能夠適合使用，這是一種錯誤的想法。新出廠的載玻片，表面復蓋著開一層油脂樣的物質，如果不加以處理，對切片的附貼是極為不利的。我們的做法是：新的載玻片，放于玻璃清洗液中浸泡4小時甚至過夜，然后取出，經(jīng)自來水徹底沖洗后，浸入酒精中達2小時以上，取出擦干備用或烘干也可。然后再將載玻片浸入了－氨基－三乙氧基－硅烷（3－Aminopropyl triethoxy-silane）的稀釋液（1：50用丙酮或無水乙醇稀釋都可以）中硅化10分鐘，后經(jīng)無水乙醇洗2次，烘干即可使用。
五、切片必須烘烤附貼牢固，既要經(jīng)得起抗原修復時高溫的作用而不使輕易脫片，又不至于破壞抗原。
應用于免疫組化染色的切片。由于整個過程需經(jīng)幾個階段的處理，如抗原修復時抗原修復液的沸騰且需持續(xù)十幾分鐘，PBS的反復沖洗，有的甚至于4℃冰箱中孵育達十幾小時。因此，對切片的質量要求很高，尤其是切片的附貼程度。以往有人主張切片在60℃以下烘烤30-60分鐘即可按此進行結果是切片掉片嚴重，切片松動率占100%。切片究竟烘烤多長時間才合適，既不脫片和適合各項要求，又不至于破壞抗原。幾組實驗［］診斷P173認為，切片在60℃的恒溫干燥箱中烘烤2-5小時最為合適。這是因為：抗原可耐受如此的溫度，病理科一般使用的石蠟，其熔點在60℃左右，組織浸蠟時，浸蠟箱中的溫度，一般都調在65℃左右，組織在這樣溫度中要浸泡2小時以上，才能達到徹底地浸蠟。組織中的抗原已經(jīng)受了65℃的溫度考驗，保存下來的抗原，都已具有耐熱性。另外，經(jīng)上述時間烘烤出來的切片，附貼牢固，抗原保存好，染色成功率達100%，保證了病理診斷的及時性和準確性。
特需要注意的是，不管是應用于診斷的切片還是研究用的切片，烘烤后應盡快進行染色。如果切片切完后，遲遲不進行染色，存放于室溫中或工作冰箱中，切片中的抗原將會隨著時間的延長而逐漸消失，甚至出現(xiàn)假陰性。原則上是新鮮切片，即行染色，染多少張切多少張，這樣才能盡可能的保存表達更多的抗原。
六、切片脫蠟必須干凈，否則將會影響免疫組化染色的最后結果。
蠟不溶于水，不與其它的臨床使用的抗體相融合。它只能靠特用的試劑，處理足夠的時間，才能將其除去。如果脫蠟不干凈，少許蠟存留于切片上，將會引起許多弊病，如染色不均勻，陽性物時隱時現(xiàn)，真假難辨，背景染色增加等。為了解決上述的問題，切片在染色前必須徹底脫蠟，目前用于脫蠟的試劑主要是二甲苯，因它脫蠟力強，脫蠟時間較短。較受使用者的青睞。脫蠟的時間要根據(jù)季節(jié)，室溫和試劑的新鮮謀面是在不同。如果在夏天，室溫較高，脫蠟試劑也新鮮，則脫蠟時間不需很多，3-5分鐘就已足夠。如果在冬天，室溫較低，脫蠟試劑也較陳舊，則脫蠟時間需要延長，10-20分鐘或更長�？傊�，操作時應根據(jù)不同的季節(jié)，不同的室溫，不同的試劑來決定，脫蠟的時間，原則上是要徹底，干凈，完全地脫去切片上的蠟。為了做到這一步，切片在脫蠟前的加溫將有助于完成上述的要求。比如：當天切的切片，燒烤2小時后進行染色，切片帶有溫度進行脫蠟這將可加速脫蠟的過程，如果預先切好烤好的切片，在染色前，還必須對切片進行加溫10-20分鐘，然后再行脫蠟，這樣脫蠟速度加快，效果魁偉更好。
七、必須徹底抑制內源性過氧化物酶的活性，才能降低背景的染色。
在各種組織中都含有很多的內源性過氧化物酶，尤其在紅細胞，中性粒細胞，單核細胞嗜酸性細胞，出血的組織壞死的組織等等。含有這種酶的各細胞和組織如果在染色前不對其進行處理和抑制，它們將會在DAB底物的顯色時，與HRP一樣催化底樣，使之顯色，使之生成與陽性物一樣的黃棕色，造成混亂。為止，在免疫組化染色前，都必須對內源性過氧化物酶進行抑制。當然，對它們進行徹底的消除是不行的，因為抑制太厲害，對抗原也會有相同的抑制作用。氫在抑制內源性過氧化物酶時，也要注意對抗原的保護抑制也只能對它們中的大部分在DAB顯色后，顯示出淡黃*色，這就足以與真正陽性物的區(qū)別。抑制劑常用的是0.3%的H2O2，也可將其稱為1%H2O2，因為市售的H2O2的濃度為30%，按其凈含量則為0.3%，如果按其溶液的用量則為1%。
關于H2O2的使用，有的使用是單純的H2O2稀釋溶，有的使用是H2O2甲醇混合 物。根據(jù)實驗，認為H2O2甲醇較適合于大多數(shù)的情況，因為除了H2O2外，甲醇對各種酶，都有鈍化的作用，因此H2O2甲醇的雙重作用效果較好。陳尚平等認為在多數(shù)情況中，用甲醇H2O2已經(jīng)獲得令人滿意的結果。
八、須適當合理地使用封閉試劑
為了減少背景產(chǎn)生的非特異性染色，在免疫組化染色的過程中，在加入一抗孵育前，常常加入非免疫動物血清，以減少背景的染色，陳尚季等認為：抗體是高度的電荷分子，可能與帶有相應電荷的組織成分無特異性地結合（如膠原）。由于這種非特異性結合，將導致標記的部分局部化（軛合物）和膠原的假陽性染色。要用一種不相干的抗體居先處理，可能減少和標記的抗體無特異性結合。
以往，血清的使用有很多，如：小牛血清，馬血清，山羊血清，綿羊血清，兔血清，濃度也有很多種，如：1%.2%.或1：5、1：10、和1:20.
必須選擇合適的抗體以及對作適當?shù)谋４婧团渲啤?br>
九、選擇合適的抗體
至今為止，應用于臨床的常用抗體有幾十種，在這當中又可分為兩種類型。
1.濃縮型抗體
根據(jù)近幾年來使用的情況認為，它有許多優(yōu)點，但也有許多不足之處：
①可作為各種疾病檢測的常備抗體。在各單位的常規(guī)活檢診斷中，有常見的病例，也有罕見的病例，尤其是后者，有時很長時間才遇到一例，這就給抗體的應用和備用提出了更高的要求，如除了常用的抗體外，還需備用一些較為罕見病例的抗體。這樣才能解決臨床的診斷問題，如臨時購買，則需較長的時間，這樣就會延誤診斷。實踐證明：濃縮型抗體，可作為常備檢測抗體。當購買抗體后，根據(jù)檢測病例的數(shù)量，在無菌的條件下，將抗體分成小包裝，然后用蠟膜封起來，于－30℃的低溫冰箱中保存，臨用時取出一支，用指溫促其回升至室溫，然后用PBS稀釋即可使用，這種抗體可保存3年左右。
②成本低，價格較便宜。
它與即用型的抗體相比較，價格要便宜好多，如以某公司2002年-2003年的CK為例，濃縮型的抗體0.1ml，價格260元，該抗體可稀釋為5000ml，以每張切片所需抗體為50ul計，可標記100例，每例一抗體所需2.6元，而即用型抗體1.5ml，價格150元，可標記30例，每例一抗體需5元。
③需要稀釋抗體，手續(xù)較為復雜�！ τ谛沦徣氲臐饪s型的抗體，使用時必須將稀釋為工作液，才能使用，對于從未用過的抗體，還必須實驗其實際的稀釋度，因為各種抗體，廠家都做了相應的稀釋度的實驗，但這是大概的稀釋度，要使抗體真正適合于本單位的稀釋度，就必須對抗體的稀釋度進行實驗，如1:100.1:75.1:50.1:25等，如果結果在1：50上是最佳結果，這就是最佳的稀釋點，如果在這范圍內找不出最佳稀釋點，則應繼續(xù)實驗直到找出最佳稀釋點為止。
④需要配置各型號的微量加樣器，以利于量取精確的抗體量。
⑤需要具備一定的英語水平，因為濃縮型的抗體多為進口試劑，其使用書都以英文為主，其中涉入抗體的來源，適應讓稀釋對什么組織或細胞可起反應等。
2.即用型抗體。
近幾年來，免疫組化技術應用的推廣，即用型抗體的應用越來越受到人們的歡迎，根據(jù)幾年來的使用，認為它有許多優(yōu)點和不足：
①使用方便。對于初學者來說，它是一種最好的抗體，不管什么樣的病例和切片，只要有抗體，不需要自己摸索稀釋度，拿起試劑瓶一滴即可，極不方便。
②對于不具備或基本不懂免疫組化技術的人，只要按照說明書的方法使用，也能獲得理想的結果。
③不需要配置多種昂貴的微量加樣器�，F(xiàn)今的微量加樣器，如為進口貨，貴者多達兩千多元。而即用型抗體無需再行稀釋，即買即用，無需配備其余器械。
④特別適合于基層單位�；鶎訂挝唬瑹o需多大的投資，就能開展免疫組化的工作，這對于提高診斷的準確率，極有好處。
⑤價格較濃縮型抗體貴。
⑥即用型抗體不可作為常備貯存抗體。即用型抗體，一般有效期為一年。如果用量大的單位，對于3ml一個包裝的抗體，一年需要用幾支，這對抗體來說，不會造成浪費。但如果為較小的單位，一年中標記的病例較少，購買抗體時也盡量選小包裝的抗體，如1.5ml。如果碰上罕見的病例，有時一年也標記不了幾例，這樣就應采用濃縮的了。即用型的抗體，有效期為一年，但真正購買到的抗體使用期就不可能為一年，因為抗體從生產(chǎn)商到銷售商的手里，需要一定的時間，如果運氣好的話，你購買到的抗體，是剛交到銷售商的手里，那么，使用的時間可能長些，但如果在銷售商的手中滯留了一段時間，抗體的有效使用期就可能不會太長，五個月、六個月或者三個月。如果在有效的時間內不能使用完。稍為超過一些時間還可以，如果時間過長，就應當丟棄，因為會影響標記的質量。有人抱怨，剛買的抗體標記很好，后來就漸漸不好了。這是因為隨著時間的延長，抗體的活性會逐漸失去生物活性，導致了標記質量的下降。
（2） 抗體的適應癥。
在眾多的抗體中，按它們的實際使用范圍，把它們分為兩個類：
1.適合于冰凍切片，涂片，細胞培養(yǎng)片。
2.適合于石蠟切片，冰凍切片，涂片和細胞培養(yǎng)片。
（3）選擇合適的單克隆或多克隆抗體。
抗體除了分為上述的兩個類外，從其克隆的高度講，也有單克隆和多克隆之分。
1.單克隆抗體，在目前臨床常用的抗體當中，大部分都是單克隆抗體。這要歸功于生物技術的不斷提高。在早些時候，應用于臨床的抗體，大多數(shù)為多克隆抗體。
2.多克隆抗體，在臨床應用的抗體中，還有少部分的抗體為多克隆抗體。
（4）抗體的加入。
這看似很簡單的問題，如果處理不好也可導致不同的結果，如果應用自動免疫組織化學染色儀，將程序輸入即可，如為手工操作，就必須注意以下的問題：
1.當PBS沖洗完畢后，在加入抗體，如一抗，二抗或三抗。必須將存留于切片上的多余的PBS摔干，但不能讓切片干涸，切片干涸，往往可產(chǎn)生非特異性染色，切片上PBS存留過多，將會稀釋加入的抗體，影響加入抗體的濃度，同時也將影響最后的結果，如假陰性等。
2.加入的抗體以一滴為佳。
當擦干組織塊周邊多余的PBS后，切片保持著一定的濕潤度，此時加入另外的抗體為最佳時候，滴入抗體以一滴50ml為好，加入后，輕微地搖勻地覆蓋于切片上，使最后的結果穩(wěn)定均衡，不至于有的地方有反應，有的地方無反應。
3.切片沒擦好將會影響加入抗體的質量，切片沒沖洗干凈，沒擦試好，當加入抗體后，它可縮于切片的一邊，此時你為了使加入的抗體能夠完全地覆蓋整個切片，便會使勁地加入抗體，此時的結果是，抗體依然滑向一邊，或者完全露出，這不光沒達到目的，還浪費抗體，正確的做法就是徹底地用PBS沖洗，摔干切片擦干切片周邊的PBS，再滴入一滴抗體輕輕搖勻即可。
（5）選擇合適的孵育時間。
第一抗體的孵育時間，有較多的使用范圍，應用于臨床檢測抗體的孵育時間。一般室溫下孵育在30-60分鐘，120分鐘，對于研究性質的抗體孵育時間，也可按照上述的時間，但也有人提出于4℃冰箱中過夜孵育，根據(jù)我們的經(jīng)驗一般不主張于4℃冰箱中過夜，原因是：
1.長時間的孵育可以使一些非特異性的物質沉淀下來，或者被吸附，造成背景的染色。
2.目前銷售的抗體，純度較高，特異性較強，不需要長時間的孵育，也能夠結合得很好 。
3.長時間的孵育，較容易引起切片的脫落，造成染色的失敗。
4.長時間的孵育，不利于臨床病理報告的發(fā)出。
十、連接抗體的選用必須正確，否則可造成假陰性的現(xiàn)象。
免疫組化染色方法較多，如ABC法，SP法和EV二步法等，如果使用的是SP法，或者ABC法，這時就必須要仔細地選擇好連接抗體，第一抗體有單克和多克隆炎分，連接抗體則要根據(jù)選用的抗體來進行，例如：第一抗體選用的是單克隆鼠抗人**抗體，連接抗體也要選擇相應的免抗鼠IgG，這樣才能連接上（目前生產(chǎn)廠家已生產(chǎn)出混合型抗體，即既適合于單克隆抗體，也適合于多克隆抗體。使用者不用擔心連接不上，隨便使用都可，但如果沒有訂購混合型的試劑盒，就必須注意的型號，使之完全適合所選用的抗體。）孵育的時間可在10分鐘，20分鐘或者30分鐘，一般在室溫中進行，如果室溫低于20℃以下，則可在37℃的孵育箱中進行。
十一、復合物的使用及孵育時間的確定。
各種方法有各自的復合物，如ABC法，復合物是卵白素和生物素結合的復合物，再帶有HRP，SP法，（LsAB法）的復合物是鏈雪菌素蛋白復合物，再帶有HRP，EV二步法的復合物則是二抗和三抗連接在一起的復合物，再帶上HRP，除此之外，根據(jù)水解底物的不同，可產(chǎn)生不同的顏色，例如：帶有HRP的酶，水解的底物一般為DAB產(chǎn)生黃棕色，帶AP的酶，水解的底物一般為AEC產(chǎn)生紅色。
十二、PBS的沖洗
免疫組化的染色過程，除了前面的處理和加入的抗體外，都在PBS的沖沖洗洗中度過，PBS沖洗的正確與否，也是導致最后結果的關鍵。
1.單獨沖洗，防止交叉反應造成污染�！�
臨床上每天檢測的病例很多，所用的抗體種類及項目也多，如果在加入一抗孵育完后，將它們在一個缸內洗，這樣就會造成交叉污染，影響最后的結果。正確的做法是單獨地進行沖洗，沖洗的PBS為一次性，保證切片沒有相互交叉污染的機會。
2.溫柔沖洗，防止切片的脫落。
沖洗切片，取出切片，將PBS從上輕輕地沖洗，讓PBS自上而下流下來，不要拿起切片將PBS對準切片沖洗，這樣由于沖出的PBS有一定的沖擊力，很容易使切片周邊引起松動，導致切片的脫落。
3.沖洗的時間要足夠，才能徹底洗去結合的物質。
沖洗切片有人提出用微振蕩器振染，振下未結合的各種物，使之不產(chǎn)生背景，此種做法一是浪費時間，二是很容易導致切片的脫落。切片的沖洗據(jù)實踐認為，用一小燒杯柔和地于切片上沖洗，就能徹底沖洗去未結合的物質，無需附加其它條件，沖洗好于切片上再注入PBS，持續(xù)2分鐘左右就完全足夠了。
4.PBS的PH和離子強度的使用和要求。
劉彥仿指出：中性及弱鹼性條件（PH7－8）有利于免疫復合物的形成，而酸性條件則有利于分解；低離子強度有利于免疫復合物的形成，而高離子強度則有利于分解。［］免疫組化P56我們目前常用的PBS的PH在7.4-7.6濃度是0.01M，根據(jù)本室十幾年來的使用情況，認為該溶液價格便宜配制方面，使用效果好。
5.常用試劑的配制和使用。
在免疫組織化學的染色過程中，用得最多的試劑就是緩沖液，因為切片在整個染色中，抗體的加，換，切片的沖洗，DAB的配制都離不開緩沖液。可見緩沖液在整個染色中都起至關鍵的作用，緩沖液的過酸或偏堿，都將影響染色的結果。下面將介紹有關方面的內容：
（1）緩沖液的配制
1.磷酸鹽緩沖液（Phosphate buffer solution.PBS）
Ⅰ液：0.2M Na H2PO4貯存液（PH7.6）
取一個具500ml的容量瓶，稱量15.60g NaH2PO4﹒12H2O倒入瓶中，加入少量蒸餾水使勁搖晃，直至溶解，加入蒸餾水湊足500ml。放于4 冰箱保存，配制時應注意的事項：
①在配制時，要先確定NaH2PO4的用量，因為該試劑有許多種類形，它們所含的水分子量不一樣，因而它們的用量也不一樣。如NaH2PO4含單個水分子時，配制時要稱取13.80g，而當含有2個水分子時，則需要稱取15.60g。
②配制時根據(jù)要求選取蒸餾水。因為蒸餾水有數(shù)種，單蒸餾水，雙蒸餾水，玻璃蒸餾水，去離子水。如沒特別要求，選用一般的蒸餾水配制則可。
③裝緩沖液的瓶子須用玻璃浸洗液泡洗過，以防污染，導致溶液中有雪菌生長。
Ⅱ液：0.2M NaHPO4貯存液(HP7.6)
取500ml的容量瓶，稱好17.91g NaHPO4﹒12H2O,倒入瓶中，邊加水邊攪拌，直至完全溶解再湊足500ml，貯存于4℃冰箱。
注意事項：
①該試劑也應注意有多種不同的含水分子量。
②該貯存液久放后可出現(xiàn)結晶。每次使用前，先取出回至室溫，搖晃其結晶溶解，也可用微波爐促其快速溶解，然后再用。
0.01M PBS工作液的配制：
取一2000ml的容量瓶一個，裝入已稱好的NaCt18g，加入少量蒸餾水讓其徹底溶解，再加入 Ⅰ液13ml，Ⅱ液87ml，加蒸餾水湊足2000ml，即可使用，即可使用該溶液在室溫下可保存3-4周，但以新配為佳。
PBS工作液配制完畢后，都要測其PH值，如果偏酸，可用氫氧化鈉來調試，如果偏堿可用HCl調試，測試有如下n種方法：
①PH測試筆測試，這是一種簡便、易行、結果較為準確的測試方法。當配制完PBS后，取一小杯，倒入配好的PBS，插入測試筆，打開開關，小屏幕上將可出現(xiàn)測出的PH結果。PH如果7.6不足，小量的可用0.2M Na2HPO4調校，大量的可用氫氧化鈉調校。PH如果高于7.6，小量的用0.2M NaH2PO4調校，大量的可用HCL來調校。
②用試紙來測試：PH試紙有兩種，一種為廣泛PH試紙，范圍在1-14，另一種是精密試紙有各種各樣的范圍。但是，作為沖洗切片用的PBS，其精確度不需要十分精確，如配PH7.6時，測試時在PH7.5或7.7，都可使用。試紙測試PH值，�？科浞磻念伾珌泶_定，十分簡便，一般的試劑都可用它來測試。
③儀器測試：對于要求較高，需較準確的PH值，須彩用儀器測試。
1.Tris緩沖溶液(Tris buffer solution,TBS)
①1N HCL ，濃HCL(雙重1.19)8.3ml，先取50ml蒸餾水，加入HCL再加水到100ml。
②0.5M Tris-HCL緩沖液(PH7.6)
取Tris(羥甲基氨基甲烷)6.57g，加入少許的蒸餾水攪拌，直至溶解，再加入1N HCL42ml，然后用蒸餾水湊足100ml，于4℃冰箱保存。
臨用時，將上述溶液10稀釋倍，即為0.05M工作液。
注意事項：
①配制1N HCL時，如果大量配制，HCL入水時可產(chǎn)生很大的熱量，對的所用的玻璃器皿應特別小心，以防突然產(chǎn)熱而使玻璃器皿爆裂。
②調校PH值時，可參考上述的三種方法
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