有色樣品細菌內(nèi)毒素檢測方法之顯色法的革新與應用

圖1. 革蘭氏陰性細菌細胞內(nèi)毒素結構示意圖

二、出于對顏色的好奇：顯色法檢測背后的科學
您是否曾好奇動力學顯色試驗的奧秘？這項藥典技術背后隱藏著令人驚嘆的科學原理。
 

圖 2. LAL級聯(lián)機制描述和動力學顯色試驗的方法原理
 

顯色試驗之所以神奇，在于其結合了簡便性、線性度和準確性。試驗中，除了利用級聯(lián)機制中的LAL酶（包括因子C、因子B和凝血酶原）外，還引入了顯色底物這一關鍵元素。最初，顯色底物呈無色狀態(tài)，但當它與被細菌內(nèi)毒素活化的凝血酶相遇時，一場化學反應悄然發(fā)生。

圖3..ACC 顯色試劑中使用的顯色底物示例.png

凝血酶會裂解精氨酸-發(fā)色基質中的CO鍵，釋放出一種叫做對硝基苯胺（pNA）的發(fā)色團——一種能吸收光（最大吸收值接近405nm的可見光）的微粒，從而引發(fā)溶液顏色變黃，這一變化肉眼可見。

為了精確測量這一顏色變化，科學家們采用吸收光分光光度計進行定量分析。根據(jù)以往經(jīng)驗，顏色的深淺程度與樣品中細菌內(nèi)毒素的含量成正比。因此，通過顯色試驗，我們能夠快速、準確地評估樣品中的細菌內(nèi)毒素水平。
 

圖4. 在405nm 波長處測量的吸光度與內(nèi)毒素濃度定義的典型示意圖
 

自20世紀90年代以來，顯色檢測技術憑借其獨特的優(yōu)勢，徹底改變了細菌內(nèi)毒素檢測領域的游戲規(guī)則，成為生物學與比色法完美結合的典范。

三、重組顯色測試如何進一步提高產(chǎn)出？
重組顯色檢測法通過引入幾項突破性功能，將其優(yōu)勢提升到了新的高度。
 

圖5. 一個典型的微孔板顯示了動力學顯色試驗的顏色變化

首先，重組級聯(lián)試劑（rCR）PyroSmart NextGen®采用了重組因子C、重組因子B和重組凝固酶原，這些因子是從美洲鱟（Limulus polyphemus）中基因克隆并表達的級聯(lián)酶制劑，這一變革使得檢測過程中無需再使用動物源成分，從而實現(xiàn)了更加環(huán)保的檢測方式。
 

圖6. 重組級聯(lián)試劑的作用機制

此外，PyroSmart NextGen®試劑中不含動物源LAL試劑中的原生成分因子G，這一改進避免了因(1→3)-β-D-葡聚糖（一種常見污染物）引發(fā)的共敏性問題，進而顯著降低了檢測結果超范圍的風險。
 

圖7. 含有和不含(1→3)-β-D-葡聚糖加標的兩個RSE標準系列的起始時間（秒）的線性回歸
 

圖8.使用六種不同批次的PyroSmart NextGen®的RSE標準曲線系列，顯示出很強的批次一致性

尤為重要的是，該試劑確保了批次間結果的高度可重復性，這一特性為質量控制實驗室實現(xiàn)標準化和現(xiàn)代化，特別是推動移液自動化進程，奠定了堅實的基礎。

在ACC(Associates Of Cape Cod)，PyroSmart NextGen®于相同的cGMP條件下生產(chǎn)，保證了其質量和性能的一致性和可靠性。與此同時，rCR與我們已獲得FDA許可的LAL試劑一樣，均在通過ISO 14385認證的工廠生產(chǎn)，這不僅確保了檢測結果的可靠與可重復，也使rCR成為細菌內(nèi)毒素檢測領域中一個值得信賴且可持續(xù)的解決方案。

四、揭開秘密：有色樣品檢測背后的數(shù)據(jù)
有一種常見的誤解，認為顯色法在處理有色樣品時會遇到困難。然而，通過實際數(shù)據(jù)和經(jīng)驗證明，當方法適用性良好時，顯色法，包括重組顯色法，能夠高效且準確地檢測有色樣品。根據(jù)USP<85>和<1085>的規(guī)定，對所有樣品進行方法適用性測試是常規(guī)測試前的必要步驟，這有助于確定適當?shù)臋z測方法，并評估檢測設置（如試劑類型、方法類型和儀器）與樣品的兼容性。

趣聞1：大多數(shù)藥物樣本類型都會干擾BET。
趣聞2：絕大多數(shù)樣品干擾都可以通過簡單的BET檢查用水稀釋［如LAL試劑水(LRW)］來克服。

有色樣品也不例外。除了固有的顏色外，它們通常還可能含有干擾測試的成分。根據(jù)我們的經(jīng)驗，用LRW（如無熱原水）稀釋極有可能在一個簡單的步驟中解決光學和化學干擾這問題。

除了稀釋外，還有另一個非常有價值的工具：儀器和軟件。先進分光光度法的出現(xiàn)大大緩解了人們對測試有色樣品的擔憂�；�線設置和歸零在此過程中起著關鍵作用。例如，在Pyros Kinetix® Flex試管閱讀器中，每個孔都要單獨計時和評估，它涉及記錄樣品的初始吸光度。這基本上是在任何反應發(fā)生之前通過樣品的固有顏色來測量吸光度。然后將此基線讀數(shù)用作所有一系列稀釋中（不超過最大有效稀釋度）后續(xù)10秒測量的參考點，從而可以準確捕獲真實的顏色強度增加，而與樣品本身的顏色無關。

Pyros Kinetix® Flex由Pyros® eXpress軟件提供支持，該軟件內(nèi)置了每孔檢索原始數(shù)據(jù)的規(guī)范。在初始歸零期間，在405nm波長處吸收強烈顏色的樣品會產(chǎn)生較低的透射率值，因此會在軟件中標記為超出范圍，提醒操作員采取進一步措施。

五、案例研究：顯色法在有色樣品測試中的實際應用
那么，這一切是如何實現(xiàn)的呢？讓我們來看看MIC注射劑的可比性測試——一種維生素混合注射劑，由主要化合物（蛋氨酸、肌醇、膽堿）和其他成分（如維生素B12）組成。根據(jù)各成分的濃度，最終制備可能如下所示：
 

圖9. MIC注射液的系列稀釋

1. LRW中的稀釋系列（MVD=14000）
2. 加入BET水后，有色背景會被進一步稀釋
3. 使用動態(tài)濁度法（KTA）測試MIC注射液所有測試系列稀釋的陽性對照和陽性樣品對照的數(shù)據(jù)收集圖（加標濃度為0.5 EU/mL）：

圖10. 在Pyros Kinetix® Flex管式讀數(shù)器中進行動態(tài)濁度測試時，對添加了0.5EU/mL的MIC注射稀釋液的范圍進行的數(shù)據(jù)采集圖

解釋：原液-未經(jīng)測試。濃縮的MIC注射液呈深黃色，能非特異性地吸收整個可見光光譜。

圖11. 使用動態(tài)顯色法在Pyros Kinetix® Flex管式閱讀器上進行檢測時，對添加0.5EU/mL的注射稀釋液范圍所繪制的數(shù)據(jù)采集圖

（1）1:10的PPC - 固有顏色對于濁度測試來說仍然太深，仍然會非特異性地吸收通過的光，Pyros® eXpress會在測試開始60秒后通知用戶透射率規(guī)格未達標。
（2）1:100的PPC - 在0到800秒之間會有殘余的光學干擾，然后會被與細菌內(nèi)毒素反應有關的濁度變化所克服。
（3）1:1000的PPC - 無光學干擾。
（4）1:10000的PPC - 無光學干擾。
 

總之，濁度測試與顯色測試觀察到的光學干擾程度相同。在 1:100時觀察到殘余干擾。用兩種LAL方法檢測時，1:1000稀釋液都沒有光學和化學干擾，因此可以選擇1:1000稀釋液進行進一步檢測和驗證。

使用PyroSmart NextGen®進行了其他測試，將MIC注射液按1:500稀釋，足以克服光學干擾。

六、專家意見：質量控制技術人員參與其中
在制藥質量控制領域，領先的科學家和管理人員已成功驗證了有色樣品的動態(tài)顯色法測試。他們的實踐表明，根據(jù)具體情況，測試策略可靈活選擇：一些團隊直接采用顯色技術，看重其寬動態(tài)范圍的優(yōu)勢；有的則從濁度技術入手，逐步過渡到顯色技術；特別是對新產(chǎn)品的內(nèi)部測試，有些企業(yè)直接應用重組顯色法來檢測有色樣品。
 

除了卓越的分析性能，光度測定技術還積極響應3R原則（減少、替代、回收），顯著降低了試劑中動物源性原料的使用，而重組試劑更是完全摒棄了這類原料。

七、關于稀釋：獲得準確結果的關鍵
在檢測過程中，正確的稀釋技術是確保有色及無色樣品獲得準確結果的關鍵，有助于消除對顯色檢測能力的誤解。通過深入理解反應成分，運用合適的儀器和軟件平臺，并有效利用其內(nèi)置功能來標識不合格樣品，用戶能在檢測初期迅速識別問題。經(jīng)過適當?shù)姆椒ㄩ_發(fā)，顯色技術在有色樣品檢測上的表現(xiàn)與濁度技術相當，甚至在低稀釋度下，重組顯色法也能驗證結果的有效性，根據(jù)專家意見、經(jīng)驗數(shù)據(jù)和對動物福利的倫理要求，證明重組顯色法不受樣品顏色影響的穩(wěn)健性、可持續(xù)性和可靠性。

這些先進方法的采用，標志著藥品質量控制向更加標準化和現(xiàn)代化的程序邁進，不僅提升了檢測效率，還確保了醫(yī)療產(chǎn)品的安全性和有效性。