利用具有pH檢測(cè)控制和補(bǔ)料功能的新型搖床研究利福霉素SV種子培養(yǎng)過(guò)程

杜吉泉② 王軍峰 儲(chǔ)炬 王永紅 莊英萍 張嗣良③
（華東理工大學(xué)生物反應(yīng)器工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 國(guó)家生化工程技術(shù)研究中心，上海 200237）

摘要： 種子培養(yǎng)過(guò)程中pH變化規(guī)律能夠反映菌體對(duì)不同營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的利用情況及菌體生理特性的變化，可為移種時(shí)機(jī)的選擇提供線索。在實(shí)際生產(chǎn)過(guò)程中通過(guò)取樣來(lái)確定種子的生長(zhǎng)狀況存在較多弊端，而通過(guò)數(shù)學(xué)模型對(duì)種子的生長(zhǎng)進(jìn)行預(yù)測(cè)有很大的優(yōu)勢(shì)。本文利用具有pH檢測(cè)控制與補(bǔ)料功能的新型搖床，得到了利福霉素SV種子的最適接種量范圍為6～8%（v/v）及最適移種時(shí)間為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期末期（判斷標(biāo)準(zhǔn)為pH到達(dá)第二個(gè)低谷），并建立了預(yù)測(cè)菌體濃度的數(shù)學(xué)模型，檢驗(yàn)證明此模型能夠較準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)利福霉素SV產(chǎn)生菌在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期及移種時(shí)（對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期末期）的菌濃，并可用于預(yù)測(cè)在一定接種量下達(dá)到預(yù)定菌濃所需的培養(yǎng)時(shí)間。

關(guān)鍵詞： 具有pH檢測(cè)控制和補(bǔ)料的搖床；利福霉素SV； 培養(yǎng)過(guò)程優(yōu)化； 菌濃預(yù)測(cè)；數(shù)學(xué)模型

中圖分類號(hào)：TQ920.6 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

Studies on Rifamycin SV Seed Cultivation with
pH-controlled fed-batch shaker①
Du Ji-quan②, Wang Jun-feng, Chu Ju, Wang Yong-hong, Zhuang Ying-ping, Zhang Si-liang③
(State Key Laboratory of Bioreactor Engineering, National Engineering Research Center for Biotechnology (Shanghai), East China University of Science & Technology, Shanghai 200237)

ABSTRACT The variety of pH during rifamycin SV seed cultivation responses to the consumption of substrates and usually can indicate the physiological characteristics of Amycolatopsis mediterranei. The process of vegetative seed cultivation was investigated with pH-controlled fed-batch shaker (ab. pH-shaker). The optimized time window for seed transferring was the second valley of the pH profile and the optimized inoculum amount was 6~8% (v/v). Furthermore, a mathematical model for predicting the PMV of the vegetative seed process was developed, which was proved suitable for logarithmic phase of vegetative seed growth.
KEY WORDS pH-controlled fed-batch shaker; Rifamycin SV; Optimization of seed cultivation; PMV prediction; mathematical model

利福霉素（Rifamycin）是由地中海擬無(wú)枝酸菌（Amycolatopsis mediterranei）產(chǎn)生的一類安莎大環(huán)類抗生素，廣泛應(yīng)用于治療結(jié)核病、麻風(fēng)病和與艾滋病有關(guān)的分枝桿菌感染[1]。其最主要活性組分SV和B是利福平、利福噴叮等利福霉素類藥物的直接前體[2,3]。目前我國(guó)利福霉素產(chǎn)量占世界產(chǎn)量的絕大部分，但生產(chǎn)水平經(jīng)常出現(xiàn)波動(dòng)，其中種子退化及種子質(zhì)量控制不穩(wěn)定是一個(gè)主要原因，因此種子質(zhì)量的穩(wěn)定控制意義重大。
菌絲濃度是反映種子質(zhì)量的一個(gè)關(guān)鍵指標(biāo)，對(duì)它進(jìn)行在線測(cè)量目前仍是一個(gè)難題。利用數(shù)學(xué)模型對(duì)種子培養(yǎng)過(guò)程的菌濃及生長(zhǎng)狀況進(jìn)行預(yù)測(cè)是快速估計(jì)菌體濃度的有效方法之一，黃明志等[4]曾經(jīng)基于神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)對(duì)發(fā)酵過(guò)程中細(xì)胞濃度進(jìn)行了在線估計(jì)，并取得較好效果。

具有pH檢測(cè)控制和補(bǔ)料功能的新型搖床（以下簡(jiǎn)稱pH搖床），相當(dāng)于一個(gè)多罐并聯(lián)操作的簡(jiǎn)易型生物反應(yīng)器，能夠?qū)崿F(xiàn)菌株大量快速篩選、種子擴(kuò)大培養(yǎng)、生理生化特性研究、培養(yǎng)基優(yōu)化、補(bǔ)料工藝優(yōu)化等多種目的。Jutta Altenbach-Rehm等人[5,6]曾用類似裝置對(duì)重組E.coli表達(dá)GDP-manPP的發(fā)酵過(guò)程進(jìn)行了研究，結(jié)果利用優(yōu)化后的誘導(dǎo)劑IPTG的添加策略使產(chǎn)物產(chǎn)量提高了一倍。本文利用pH搖床研究了利福霉素SV種子培養(yǎng)過(guò)程最適接種量和最適移種時(shí)間，并針對(duì)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期及移種時(shí)的菌體濃度建立了數(shù)學(xué)預(yù)測(cè)模型。

1 材料與方法
1.1 實(shí)驗(yàn)用菌株
出發(fā)菌為地中海擬無(wú)枝酸菌（Amycolatopsis mediterranei）U-32，由同聯(lián)集團(tuán)上海研究所提供；實(shí)驗(yàn)用菌種為出發(fā)菌原生質(zhì)體再生后篩選得到的Y-14高產(chǎn)菌株。
1.2 培養(yǎng)方法
1.2.1 種子培養(yǎng)基[7]：母瓶與子瓶培養(yǎng)基配方相同。
1.2.2培養(yǎng)方法：甘油管接母瓶（一級(jí)種子），搖床培養(yǎng)48小時(shí)后轉(zhuǎn)接子瓶（二級(jí)種子），子瓶于pH搖床上培養(yǎng)2天左右轉(zhuǎn)接發(fā)酵瓶，發(fā)酵瓶在搖床上培養(yǎng)120小時(shí)放瓶。
1.3 主要儀器設(shè)備
SPY50雙層培養(yǎng)搖床（上海離心機(jī)械研究所）；SHpH-6型pH控制－補(bǔ)料搖床（上海國(guó)強(qiáng)生化工程裝備有限公司）。
1.4 測(cè)定方法
菌濃為PMV法；化學(xué)效價(jià)為分光光度法[8]；pH為pH搖床在線測(cè)量及pH計(jì)離線測(cè)量。

2 結(jié)果與討論
2.1 最適移種時(shí)間及接種量
2.1.1最適移種時(shí)間的判定
將母瓶按一定的接種量轉(zhuǎn)接子瓶，后者分別在pH搖床上在線測(cè)量pH值及在普通搖床上以多個(gè)平行搖瓶離線取樣測(cè)定pH值，以檢驗(yàn)二者在pH測(cè)量及變化趨勢(shì)上是否存在差異。
從Fig. 1看出，普通搖床和pH搖床所培養(yǎng)的子瓶，其pH變化趨勢(shì)基本一致，但普通搖床搖瓶的pH測(cè)定結(jié)果波動(dòng)較大，而pH搖床所顯示的pH變化趨勢(shì)更為連貫，可以更好地反映pH的細(xì)微變化和用于代謝分析。以上利福霉素種子瓶pH的變化規(guī)律簡(jiǎn)述如下：
A點(diǎn)～B點(diǎn)（8～16h）由于葡萄糖作為碳源和能源被菌體利用而產(chǎn)生酸性中間代謝物導(dǎo)致pH下降；
B點(diǎn)～C點(diǎn)（16～30h）估計(jì)此時(shí)可快速利用的碳源已經(jīng)短缺，而淀粉的水解速率相對(duì)偏低，菌體開(kāi)始利用有機(jī)氮源作為碳骨架導(dǎo)致pH回升；
C點(diǎn)～D點(diǎn)（30～44h）可能此時(shí)葡萄糖利用限制與淀粉水解之間的矛盾得到緩解，釋放出較多的糖代謝中間產(chǎn)物如有機(jī)酸等，導(dǎo)致pH再次下降；
D點(diǎn)（±44h）之后pH再次小幅回升，可能是由于碳源缺乏及菌體的開(kāi)始少量自溶引起，推測(cè)此時(shí)應(yīng)是移種的關(guān)鍵時(shí)刻。在此點(diǎn)（44h）前后分別移種轉(zhuǎn)接發(fā)酵瓶測(cè)試菌種發(fā)酵能力，結(jié)果見(jiàn)Fig. 2。





由Fig. 1和Fig. 2可知，當(dāng)種子培養(yǎng)過(guò)程pH到達(dá)第二個(gè)低谷（在此接種量下約為44h）時(shí)種子的產(chǎn)素能力最強(qiáng)；而且44h左右菌體正處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期末期（見(jiàn)Fig. 4），可見(jiàn)對(duì)利福霉素發(fā)酵來(lái)說(shuō)選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期末期移種較為合適。

2.1.2 最適接種量
分別按2％、4％、6％、8％的接種量從母瓶轉(zhuǎn)接到子瓶，檢測(cè)后者培養(yǎng)過(guò)程pH變化曲線，結(jié)果見(jiàn)Fig. 3。


由Fig. 3可見(jiàn)幾種不同接種量的種子培養(yǎng)過(guò)程的pH曲線的變化趨勢(shì)基本一致（2％接種量時(shí)，在圖示范圍內(nèi)pH沒(méi)有出現(xiàn)第二個(gè)低谷），不同之處在于形成峰值和低谷值的時(shí)間不同，說(shuō)明這幾種情況下菌體的生理代謝過(guò)程相似，即接種量沒(méi)有超出正常范圍。當(dāng)接種量太小或太大時(shí)種子培養(yǎng)過(guò)程的pH曲線同F(xiàn)ig. 3相比已發(fā)生較大變化（數(shù)據(jù)略）。
在Fig. 3所示接種量范圍內(nèi)，由于開(kāi)始培養(yǎng)時(shí)菌體濃度不同，造成對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消耗的快慢程度不同。接種量大，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消耗快，菌體生長(zhǎng)也快， pH曲線上表現(xiàn)為低谷值及峰值出現(xiàn)較早，可見(jiàn)最適移種時(shí)間會(huì)隨接種量的增大而提前，Tab. 1比較了幾種不同接種量下的最適移種時(shí)間及其相應(yīng)產(chǎn)素能力。

Tab. 1 The titers of rifamycin fermentation resulting from different inoculum sizes of vegetative seed cultivation


* 此幾種接種量下的移種時(shí)間是指pH曲線分別到達(dá)第二個(gè)低谷的時(shí)間。

由Tab. 1可見(jiàn)，接種量6％和8％的子瓶的產(chǎn)素能力最高，隨接種量的增大或減小產(chǎn)素能力有所下降。接種量過(guò)大或過(guò)小，會(huì)對(duì)菌體的生長(zhǎng)產(chǎn)生一定的影響，從而在一定程度上影響了菌濃及菌絲質(zhì)量（見(jiàn)Tab. 2），最終導(dǎo)致產(chǎn)素能力下降，故接種量應(yīng)選擇6％～8％較為合適。

2.2菌濃預(yù)測(cè)模型的建立
2.2.1假設(shè)條件
菌濃預(yù)測(cè)模型的建立，基于以下假設(shè)。
（1）利福霉素產(chǎn)生菌在生長(zhǎng)過(guò)程中經(jīng)歷四個(gè)階段：遲滯期、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、穩(wěn)定期和衰亡期。由遲滯期轉(zhuǎn)向?qū)��?shù)生長(zhǎng)期的條件是：菌體濃度要達(dá)到某個(gè)閾值Cm，只有達(dá)到了這個(gè)閾值菌體才可進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，通常Cm > a，a為初始菌濃。
（2）遲滯期菌體主要是為下一步的生長(zhǎng)作物質(zhì)的準(zhǔn)備，菌體緩慢生長(zhǎng)，因此假設(shè)遲滯期所用的時(shí)間和菌體的初始濃度成反比。
（3）兩種不同的接種量下，若菌體培養(yǎng)過(guò)程pH曲線變化趨勢(shì)一致，則可以假設(shè)當(dāng)pH達(dá)到第二個(gè)峰值時(shí)（如Fig. 1 C點(diǎn)所示）兩個(gè)搖瓶的菌體量相同（本實(shí)驗(yàn)條件下菌濃測(cè)定值為12%）。原因是接種的菌體量相對(duì)于此時(shí)的菌體量很小可以忽略，而在此時(shí)二者的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消耗基本一致，故產(chǎn)生的菌體量也應(yīng)該相同。
2.2.2 菌濃預(yù)測(cè)模型的建立
分別從母瓶中按4%和6％的接種量轉(zhuǎn)接子瓶，在pH搖床上實(shí)時(shí)記錄培養(yǎng)過(guò)程pH變化趨勢(shì)，如Fig. 3所示。由Fig. 3知二者pH達(dá)到峰值的時(shí)間分別為t1 = 38 h，t2 = 32 h；由于母瓶移種時(shí)菌濃為15％，故實(shí)際接種量（即接種后子瓶中實(shí)際菌濃）a1 = 0.6%，a2 = 0.9%，菌體的倍增時(shí)間td = 14 h。

根據(jù)假設(shè)條件， 可得遲滯期方程
(1)
對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌濃方程

(2)
由方程（2）可得：

(3)

(4)

2.2.3 模型驗(yàn)證與誤差估計(jì)
6％接種量下的子瓶對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌濃模型預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值如Fig. 4所示。

（—□－Predicted PMV； －●－Actual PMV）

由Fig. 4看出，模型預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值基本吻合，只是在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)前期及外推至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)末期（此接種量下為44h，即pH變化的第二個(gè)低谷值）誤差略大，原因有：一是對(duì)數(shù)生長(zhǎng)前期實(shí)測(cè)菌濃由于固體培養(yǎng)基的存在對(duì)菌濃的實(shí)際值產(chǎn)生了干擾，而對(duì)數(shù)生長(zhǎng)末期菌體已經(jīng)向穩(wěn)定期過(guò)渡，已不是純粹的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)；二是模型本身存在一定的偏差，因?yàn)檫t滯期和初始的接種量不一定是線性關(guān)系，同時(shí)模型所采用的倍增時(shí)間可能與真實(shí)的倍增時(shí)間有一定的偏差。


預(yù)測(cè)模型與實(shí)測(cè)值之間的相對(duì)誤差值如Fig. 5所示，雖然模型和實(shí)測(cè)值在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)前期和后期誤差略大，但總體上誤差比較小，一般在5％以內(nèi)。另外，由Tab. 2可見(jiàn)其它接種量下，移種時(shí)間的模型預(yù)測(cè)值和實(shí)測(cè)菌濃誤差也較小，個(gè)別誤差較大的原因分析見(jiàn)下文討論部分。
綜上所述，可見(jiàn)本模型能夠較準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)種子培養(yǎng)過(guò)程中對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌絲濃度變化。

Tab. 2 The predicted and actual PMV of seeds with different inoculum amount
at the optimal transfer occasion
* 接種量較大時(shí)，計(jì)算接種后初始菌濃應(yīng)考慮接種后的體積變化。

2.2.4 模型討論
（1）本模型能夠預(yù)測(cè)種子培養(yǎng)過(guò)程中的菌絲濃度變化，但是存在一定的局限性。主要是它受培養(yǎng)條件的影響，只有在培養(yǎng)基成份不變、培養(yǎng)環(huán)境不變時(shí)本模型才適用，否則模型參數(shù)需重新估計(jì)。
（2）本模型在適宜的接種量范圍內(nèi)準(zhǔn)確度較高，但隨接種量的偏離程度的增加準(zhǔn)確度會(huì)有所減小，原因可能是此時(shí)菌體的生長(zhǎng)與建模時(shí)的假定條件有所偏離。
（3）本模型不但可以預(yù)測(cè)移種時(shí)的菌濃，而且同樣能夠預(yù)測(cè)在一定接種量下達(dá)到預(yù)定菌濃所需的培養(yǎng)時(shí)間，這可為生產(chǎn)進(jìn)度安排提供方便。
（4）不同批次種子瓶的移種時(shí)機(jī)可能會(huì)略有不同，在發(fā)酵過(guò)程中純粹以培養(yǎng)時(shí)間來(lái)確定移種時(shí)機(jī)是不可取的，而要根據(jù)菌體濃度、菌體形態(tài)、生化檢測(cè)指標(biāo)等綜合判定。


3 結(jié)論
本文利用pH搖床得到了利福霉素SV的最適移種時(shí)機(jī)為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期末期，但具體移種時(shí)間會(huì)因接種量的改變而延長(zhǎng)或縮短；研究顯示利福霉素SV種子培養(yǎng)過(guò)程最適接種量為6～8％（v/v）；為了預(yù)測(cè)移種時(shí)的菌體濃度，本文建立了菌濃預(yù)測(cè)模型，檢驗(yàn)證明該模型能夠較準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期及移種時(shí)菌濃，同時(shí)該模型也可用于根據(jù)接種量來(lái)預(yù)測(cè)達(dá)到預(yù)定菌濃的時(shí)間，為種子移種時(shí)機(jī)的判斷提供依據(jù)。

符號(hào)說(shuō)明：
a： 初始接種量（即接種后子瓶中實(shí)際菌濃）
a1：接種量為4％時(shí)接種后子瓶中實(shí)際菌濃
a2：接種量為6％時(shí)接種后子瓶中實(shí)際菌濃
β：遲滯期系數(shù)
C：對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌濃
C1：接種量為4％時(shí)pH達(dá)到第二峰值的菌濃
C2：接種量為6％時(shí)pH達(dá)到第二峰值的菌濃
Cm：菌體進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期必需達(dá)到的濃度閾值
PMV：以離心質(zhì)量法計(jì)算的菌體濃度
t：對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期內(nèi)的任一時(shí)間
t1：接種量為4％時(shí)pH達(dá)到第二峰值的時(shí)間
t2：接種量為6％時(shí)pH達(dá)到第二峰值的時(shí)間
td：菌體倍增時(shí)間
τ：遲滯期
τ1：接種量為4％時(shí)的遲滯期
τ2：接種量為6％時(shí)的遲滯期

參 考 文 獻(xiàn)
[1] Queener SW, Sebek OK and Vezina C. Mutants blocked in antibiotic synthesis [J]. Rev Microbiol, 1978, 32: 593
[2] Sanfilippo, A., Della, B.C., Marsili, L. et al. Biological activity of a new class of rifamycins-piperidyl-rifamycins [J]. J Antibiot, 1980, 33: 1193
[3] Lal, R. and Lal, S. Recent trends in rifamycin research. Bioessays [J]. 1994, 16: 211
[4] 黃明志，杭海峰，儲(chǔ)炬等. 人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)在紅霉素發(fā)酵過(guò)程狀態(tài)預(yù)估中的應(yīng)用[J]. 華東理工大學(xué)學(xué)報(bào), 2000, 26 (2) : 162
[5] Jutta Altenbach-Rehm, Christina Nell, Matthias Arnold, and Dirk Weuster-Botz. Parallel Bubble Columns with Fed-Batch Technique for Microbial Process Development on a Small Scale [J]. Chem Eng Technol, 1999, 22 (12) : 1051
[6] Dirk Weuster-Botz , Jutta Altenbach-Rehm, and Christina Nell, Matthias Arnold. Parallel substrate feeding and pH-control in shaking-flasks [J]. Biochem Eng J, 2001, 7: 163
[7] 焦瑞身，陳聿美，吳夢(mèng)淦等. 地中海諾卡式菌合成利福霉素代謝調(diào)節(jié)的研究[J]. 植物生理學(xué)報(bào), 1979, 5 (4) : 395
[8] Sensi P, Thiemann J E. Production of rifamycins [J]. Prog Ind Microbiol, 1967, 6: 21

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