使用Innova®S44i搖床和離心機(jī)收獲套裝生產(chǎn)重組人磷酸絲氨酸磷酸酶

摘要

重組蛋白質(zhì)生產(chǎn)的目標(biāo)是產(chǎn)生高產(chǎn)量的功能性蛋白質(zhì)。實(shí)驗成功的重要基礎(chǔ)是細(xì)胞的培養(yǎng)以及離心（離心是蛋白質(zhì)分離和純化的基本技術(shù)）。本應(yīng)用指南描述了用作概念系統(tǒng)驗證的重組人磷酸絲氨酸磷酸酶（hPSP）的生產(chǎn)流程。從Innova® S44i 搖床中細(xì)菌培養(yǎng)物的生長開始，使用裝載 6 L轉(zhuǎn)子的高速離心機(jī)（CR30NX 或 CR22N），搭配 1.5 L 三角離心瓶收獲這些培養(yǎng)物。該離心收獲套裝可輔以“ 錐底管高速沉淀離心套件 ”（轉(zhuǎn)子含配套的 50 mL 錐底管），用于裂解后續(xù)的分離操作。結(jié)果表明，這種產(chǎn)品組合高效靈活，可為重組蛋白大規(guī)模生產(chǎn)工作流程奠定基礎(chǔ)。

前言

重組蛋白的生產(chǎn)是一項基本的生物技術(shù)，已應(yīng)用于研究、醫(yī)學(xué)和工業(yè)領(lǐng)域。這些蛋白質(zhì)由轉(zhuǎn)基因生物所產(chǎn)生。根據(jù)蛋白質(zhì)的類型及其用途，可以使用許多不同的表達(dá)系統(tǒng)（例如細(xì)菌、酵母、哺乳動物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞）。

在此過程中，所需的 DNA 序列（編碼蛋白質(zhì)的遺傳信息）通過分子克隆被引入宿主生物體。在選擇表達(dá)重組蛋白的克隆后，對其進(jìn)行培養(yǎng)。第一步，細(xì)胞繁殖，第二步，誘導(dǎo)基因表達(dá)。通常會結(jié)合使用多種不同技術(shù)來分離和純化所需的蛋白質(zhì)。最初，通過破碎細(xì)胞來分離蛋白質(zhì)與其他細(xì)胞成分（裂解）。然后利用其特性將靶蛋白與細(xì)胞的剩余蛋白分離，隨后進(jìn)行富集。

特別是如果需要對未知蛋白進(jìn)行表征（即需要研究其結(jié)構(gòu)和功能），那么需要目標(biāo)產(chǎn)物的數(shù)量會更多。尤其是兩個步驟會受此影響：必須擴(kuò)大細(xì)胞培養(yǎng)和收獲的規(guī)模（數(shù)升）。這對用于回收目標(biāo)產(chǎn)物的儀器設(shè)備會提出更高的要求，同時也會導(dǎo)致更高的工作量（如果采用體量較小的設(shè)備）。

因為易于被基因改造且培養(yǎng)速度很快，細(xì)菌大腸桿菌成為了一種普遍的表達(dá)系統(tǒng)。為了使得細(xì)胞生長足夠且蛋白質(zhì)表達(dá)充分，需要一臺能夠以升為規(guī)模對培養(yǎng)物進(jìn)行高速振蕩的穩(wěn)健搖床。重組蛋白生產(chǎn)中的另一項重要技術(shù)是離心，因為它通常涉及多個步驟。離心的目的在于收獲細(xì)胞、澄清細(xì)胞裂解物和（如有必要）濃縮蛋白質(zhì)溶液（圖 1）。離心過程中必須考慮以下要求：由于每個離心容器都需要大量手動操作步驟，收獲幾升培養(yǎng)物就變得非常耗時 (1)。一方面是培養(yǎng)體積會變化，另一方面體積較小就需要額外增加離心次數(shù)，而且用于分離、純化和濃縮蛋白質(zhì)的參數(shù)又不同，這樣一來就需要額外使用離心容器、轉(zhuǎn)子等設(shè)備，及其他可能需要的裝置。


本應(yīng)用指南闡述了通過培養(yǎng)和收獲細(xì)菌以及純化蛋白質(zhì)來生產(chǎn)重組蛋白的工作流程。目的是證明使用 Innova S44i 搖床和高速落地離心機(jī) CR30NX 可以獲得高產(chǎn)的功能性重組蛋白。為此，我們使用了離心收獲套裝，并輔以高速沉淀離心套件。這種搭配可以幫助用戶輕松且有效地執(zhí)行工藝流程的每一個步驟。
 
材料

表達(dá)系統(tǒng)
用 pET28a 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌 BL21（DE3），該質(zhì)粒含有編碼帶 His 標(biāo)簽蛋白的人磷酸絲氨酸磷酸酶（hPSP）基因（圖 2）。

培養(yǎng)系統(tǒng)
為了培養(yǎng)細(xì)菌，使用了 Innova S44i 搖床（冷凍型，軌道直徑2.5 cm）。該恒溫?fù)u床容量大，可以高速高效振蕩大量培養(yǎng)物。因此，它非常適合以升為規(guī)模對培養(yǎng)物進(jìn)行培養(yǎng)。

離心系統(tǒng)
高速落地離心機(jī) CR30NX 可與獨(dú)特的 6 L 轉(zhuǎn)子（R9A2 固定角轉(zhuǎn)）組合使用，也可匹配 1.5L 三角瓶，即上文提到的專為收獲大量培養(yǎng)物而設(shè)計的離心收獲套裝（圖 3）。該系統(tǒng)輔以高速沉淀離心套件，該套件由 R19A2 固定角轉(zhuǎn)以及 50 mL 錐底管組成。

也可以使用 Centrifuge CR22N。為此，我們也提供相應(yīng)的離心收獲套裝和補(bǔ)充套件
  圖3：A) 高速落地離心機(jī)CR30NX，B) 高速落地離心機(jī) CR22N，C) R9A2固定角轉(zhuǎn)（4 x 1.5 L轉(zhuǎn)子），帶1500 mL三角瓶，D) R19A2固定角轉(zhuǎn)，帶50 mL錐底管

方法

細(xì)菌增殖和誘導(dǎo)：
初始培養(yǎng)：向裝有 50 mL 培養(yǎng)基的 250 mL 培養(yǎng)瓶中加入50 µL 大腸桿菌（溶于甘油，含 pET28a）。將培養(yǎng)瓶放在Innova S44i 搖床中過夜培養(yǎng)（轉(zhuǎn)速 300 rpm，溫度 37 °C），直到 OD600 達(dá)到 15-25。準(zhǔn)備 3 個搖瓶進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)：向裝有1 L 培養(yǎng)基的 2.5 L 培養(yǎng)瓶中加入 5 mL 初始培養(yǎng)物。將培養(yǎng)瓶在 S44i 搖床中培養(yǎng)（轉(zhuǎn)速 250 rpm，溫度 37 °C ），直到OD600 達(dá)到約 2.0（約 4-5 小時）。加入 10 mL IPTG 后，在 37 °C 下以 250 rpm 的轉(zhuǎn)速繼續(xù)培養(yǎng) 3 小時。

收獲
在誘導(dǎo)結(jié)束時，將懸浮液回收在兩個 1.5 L 三角瓶（預(yù)先稱重）中，在裝有 R9A2 固定角轉(zhuǎn)的高速落地離心機(jī) CR30NX 中以4,000 rpm 的轉(zhuǎn)速在 4°C 下離心（7,100 x g）30 分鐘。棄去上清液。（在添加細(xì)胞培養(yǎng)懸浮液之前和離心之后對瓶子稱重，獲得沉淀的重量）。

裂解 
每克細(xì)菌沉淀中添加 20 mL 裂解緩沖液，然后用血清移液管重新懸浮。在室溫或 4°C 下攪拌 30 分鐘后，將懸浮液置于冰上超聲處理 10 分鐘（15 秒開， 45 秒關(guān)，10 次循環(huán)）。然后使用 50 mL 錐底管在高速落地離心機(jī) CR30NX 和 R19A2 固定角轉(zhuǎn)中以 12,500 rpm（32,900 x g）在 4 °C 下離心 1 小時，從而澄清裂解物�；厥丈锨逡翰⒔�(jīng) 0.2 µm 過濾器過濾。

親和層析純化
用 3 到 5 倍柱體積的蒸餾水洗滌 HisTrap® FFcrude 層析柱，再用至少 5 倍柱體積的結(jié)合緩沖液進(jìn)行平衡。持續(xù)攪拌400mL 澄清裂解液的同時，將其以 10mL/min 的流速緩慢加入層析柱。用結(jié)合緩沖液清洗層析柱，直至吸光度達(dá)到穩(wěn)定的基線（約 15 個柱體積）。通過一步操作完成洗脫：前 10 個組分用 20% 咪唑的洗脫緩沖液收集，而后 10 個組分用 100 %咪唑的洗脫緩沖液以 5 mL/ 組分 / 分鐘的流速收集。

濃縮
由于初步測試表明蛋白質(zhì)溶液濃度足夠高，因此未進(jìn)行濃縮。

分析
> 總蛋白的吸光度法定量（通過測量 280 nm 處的吸光度）。
> 在還原和變性條件下通過 4-12 %SDS-Page 電泳和考馬斯亮藍(lán)染色來鑒定蛋白質(zhì)。
> 通過孔雀綠磷酸鹽測定法測量酶活性。

結(jié)果與討論

使用 20 % 咪唑洗脫緩沖液從親和柱中獲得總共 10 個組分。這部分旨在去除雜質(zhì)。隨后用 100 % 咪唑的緩沖液洗脫 10個組分，目的是回收純化的蛋白質(zhì)。為了鑒別相關(guān)組分，測量了它們在 280 nm 處的吸光度。

圖 4 顯示了吸光度測量的結(jié)果，顯示了每個洗脫組分的總蛋白質(zhì)濃度的信息。可以清楚地看到， 100 % 咪唑洗脫緩沖液從柱中溶解下來了大部分蛋白質(zhì)。其中蛋白質(zhì)比例最高的位于100 % 咪唑洗脫的第二個組分中（= 組分 12）。
 
為了確定靶蛋白人磷酸絲氨酸磷酸酶是否存在于各個組分中，存在的量以及它是否具有功能性，通過 SDS PAGE 對各個組分進(jìn)行了分離，然后進(jìn)行孔雀綠磷酸鹽測定，從而測量酶活性。用考馬斯亮藍(lán)染色的 SDS 凝膠證實(shí)大量蛋白質(zhì)從組分 11 開始逐漸被洗脫下來（用 100 % 咪唑洗脫開始）（圖 5）。顯示最高蛋白密度的條帶位置暨為靶蛋白 hPSP，其大小為 25 kDa。污染物在開始時被 20 % 咪唑緩沖液洗脫下來。
 
孔雀綠磷酸鹽測定法是一種比色法，可通過釋放的磷酸鹽量來測定磷酸酶的活性。測定結(jié)果表明，大量功能性hPSP被含100 %咪唑的洗脫緩沖液洗出，與吸光度測量結(jié)果一致，最大酶活位于組分12處。（圖6）。
 
結(jié)果表明，Innova S44i 搖床和高速落地離心機(jī) CR30NX 以及上述實(shí)驗配件可以成功地用于高產(chǎn)率的重組蛋白的生產(chǎn)和純化。憑借其穩(wěn)健的設(shè)計和高容量，Innova S44i 搖床能夠高效地培養(yǎng)微生物，即使是大量培養(yǎng)物其也能應(yīng)對自如 (2)。上述種種均是實(shí)現(xiàn)細(xì)胞旺盛生長和蛋白高表達(dá)的基本要求。

高速落地離心機(jī) CR30NX 和 CR22N 配備眾多轉(zhuǎn)子和離心管（包括可用于放大選項的連續(xù)流轉(zhuǎn)子），用途非常多樣。由 4 x 1.5L 轉(zhuǎn)子和相應(yīng)的 1.5 L 三角瓶組成的離心收獲套裝是用于收獲細(xì)胞的最佳搭配。1.5 L 獨(dú)特的三角形設(shè)計可以輕松實(shí)現(xiàn)沉淀物再懸浮、上清液回收和瓶身的清潔。此外，單個瓶便可處理 1.5L 培養(yǎng)物，節(jié)省了每個處理步驟的時間，包括：灌裝、平衡、封瓶、轉(zhuǎn)子裝載、傾倒、顆粒再懸浮和回收，以及每個瓶子的清洗。第 64 號白皮書中提到，與處理 6 個 1 L 容量的瓶子（6 x 1 L 轉(zhuǎn)子標(biāo)配）相比，使用 1.5 L 離心瓶可以節(jié)省 32 % 的處理時間 (1)。還有一點(diǎn)揭示了該系統(tǒng)的高度靈活性：1.5L 三角瓶可不受最小裝液量的限制（傳統(tǒng)離心瓶就會受此限制）。

根據(jù)應(yīng)用情景的不同，可以額外搭配離心套件（轉(zhuǎn)子和離心管的組合）來對本離心收獲套裝進(jìn)行擴(kuò)展。只需要另外使用一個離心套件（錐底管高速沉淀套件）即可涵蓋從收獲到濃縮生產(chǎn)重組蛋白的所有離心步驟。這意味著Innova S44i搖床和高速落地離心機(jī)可以應(yīng)用于細(xì)胞培養(yǎng)、收獲和后續(xù)純化的全流程步驟。

結(jié)論

本應(yīng)用指南展示了成功使用Innova S44i搖床和高速落地離心機(jī) CR30NX（包括轉(zhuǎn)子和容器）來生產(chǎn)重組蛋白的流程。除了具備產(chǎn)量高且功能經(jīng)過驗證的優(yōu)點(diǎn)，各個實(shí)驗步驟的執(zhí)行也十分高效。這得益于產(chǎn)品之間的組合使用使得各自的配件實(shí)現(xiàn)了彼此間功能的互補(bǔ)，為實(shí)驗流程提供了基本的框架支撐。特別值得一提的是，獨(dú)特的1.5 L三角瓶以及靈活的離心收獲套裝/套件組合使得操作方便且省時，為多種應(yīng)用場景提供了簡明的解決方案。


Acknowledgement
We thank Professor Johan Wouters (Laboratoire de Chimie Biologique Structurale (CBS), Namur Medicine and Drug Innovation Center (NAMEDIC), Namur Research Institute for Life Sciences (NARILIS), University of Namur (UNamur), B-5000 Namur, Belgium) for providing the hPSP plasmid.

Literature 
[1] Tacheny A. Unique 4 x 1.5 L Capacity Rotor for High-Speed Centrifuges CR22N and CR30NX, Eppendorf White Paper No. 64
[2] Hartmann I, Jarvis J. The New Eppendorf X-Drive – Maximum Performance, Flexibility and Longevity for Demanding Shaker Tasks. Eppendorf White Paper No. 47

Application Note No. 451, 附錄 1: 材料與方法補(bǔ)充細(xì)節(jié)

材料
試劑

SRAM 培養(yǎng)基：
>100 mM MOPS 緩沖液，pH 7.4，含 24 g/L 酵母提取物，16 g/L 胰蛋白胨，10 g/L 酪蛋白水解物和 10 mL/L 甘油（100 %）
> 高壓滅菌
> 加入 500μL/L 消泡劑 204 10 % 和 2.5 mL/L 卡那霉素溶液（10 mg/mL，溶劑為 0.9 % NaCl）。
1 mM IPTG 溶液（最終濃度）

裂解緩沖液：
> 0.2 g/L 溶菌酶溶液，3000 U/L Benzonase® 核酸酶，1mM MgCl2，20 片 /L cOmplete™，不含 EDTA 的蛋白酶抑制劑混合物溶于結(jié)合緩沖液

結(jié)合緩沖液：
> 100 mM NaCl，25 mM HEPES，10 mM 咪唑溶于分子生物學(xué)級水
> 調(diào)節(jié)pH 至 7.4
>使用前經(jīng) 0.22μM 過濾器過濾

洗脫緩沖液（100 % 和 20 % 咪唑）：
> 100 mM NaCl，25 mM HEPES，250 mM 咪唑（100 %）或 50 mM 咪唑（20 %）溶于分子生物學(xué)級水
> 調(diào)節(jié)pH 至 7.4
>使用前經(jīng) 0.22μM 過濾器過濾

耗材
> Ultra Yield® 250 mL 和 2.5 L 無菌培養(yǎng)瓶（Thomson）
> AirOtop™ Enhanced Seals 透氣蓋，適用于 Ultra Yield® 250 mL 無菌專利培養(yǎng)瓶（Thomson）和 2.5 L無菌專利培養(yǎng)瓶（Thomson）
> HisTrap® FF crude 5 mL 預(yù)裝柱（GE Healthcare）

設(shè)備
> Watson Marlow 323 dz 蠕動泵
> Q500 超聲波破碎儀，帶 ½" 探頭（QSonica®）
> NanoDrop® ND 2000 超微量分光光度計（Thermo Fisher Scientific）
> xMark 微孔板分光光度計（BioRad®）

方法

光度分析
通過測量 280 nm 處的吸光度，進(jìn)行總蛋白吸光度定量。

SDS PAGE 電泳和 Coomassie Blue® 染色
通過用考馬斯亮藍(lán)染色的 4-12% SDS-PAGE 驗證蛋白質(zhì) hPSP 的純度，同時確定不同組分中是否存在污染物。按照 NuPAGE® 技術(shù)指南（Thermo）制備用于還原和變性條件下的凝膠電泳的樣品和緩沖液制劑。將 4.37 μL NuPAGE LDS 樣品緩沖液和 1.75 μL NuPAGE 樣品還原劑添加到 11.4 μL 樣品中（分別取自每個組分）。將混合物在 70°C 下加熱 10 分鐘，以完成還原和變性，然后將每個樣品（16 μL）上樣到 NuPAGE 4-12% bis-Tris 蛋白凝膠（1.0 mm，10 孔（Thermo））的孔中。蛋白質(zhì)分子量標(biāo)記物已上樣到每個凝膠中。凝膠在 XCell SureLock® 小型電泳槽（Thermo）和 NuPAGE MES SDS 電泳緩沖液（Thermo）中以 200 V 恒定電壓運(yùn)行，電流：初始電流：125 mA/ 凝膠，終末電流：70-80 mA/ 凝膠，持續(xù) 35 分鐘。電泳后，在振蕩器上以 60 rpm 的震蕩速度用去離子水將凝膠清洗 15 分鐘。使用 GelCode®Blue Safe 染色劑（Thermo）在室溫下以 60 rpm 的攪拌速度對蛋白進(jìn)行染色 1 小時。在掃描前，用超純水代替染色試劑，以 60 rpm 的震蕩速度在室溫下將凝膠漂洗脫色 2 小時。

酶活性測定
使用孔雀綠磷酸鹽分析試劑盒（Sigma）測定磷酸鹽含量來鑒定酶活性。當(dāng)酶促反應(yīng)產(chǎn)生無機(jī)磷酸鹽時，該方法可使用孔雀綠來對在620 nm 處形成的磷鉬酸鹽進(jìn)行定量。96 孔板中每孔 80 μL 樣品。每孔加入 20 μL 工作試劑。將樣品在室溫下孵育 30 分鐘，讓其顯色。然后用酶標(biāo)儀在 620 nm 處測量吸光度。