生物芯片的技術(shù)核心

所有的生物芯片技術(shù)都包含四個(gè)基本要點(diǎn)：芯片的制作、雜交或反應(yīng)、測(cè)定或掃描、數(shù)據(jù)處理。生物芯片的技術(shù)核心是芯片的制備及反應(yīng)信號(hào)的檢測(cè)。

1、芯片制備技術(shù)
目前制備芯片的方法基本上可分為兩大類：一類是原位合成(in situ Synthesis)；一類是合成后交聯(lián)(post-synthesis attachment)。原位合成是目前制造高密度寡核苷酸芯片最為成功的方法。在制備基因芯片時(shí)要考慮陣列的密度、再生性、操作的簡(jiǎn)便性、成本的高低等幾方面的因素。
具體而言，比較典型的DNA芯片制備方法有4種：第一種方法是Affymetrix公司開發(fā)的光引導(dǎo)原位合成法，該方法是微加工技術(shù)中光刻工藝與光化學(xué)合成法相結(jié)合的產(chǎn)物。第二種方法是Incyte Pharmaceutical公司采用的化學(xué)噴射法，該方法是將合成好的核昔酸探針定點(diǎn)噴射到芯片上并加以固定化來制作DNA芯片。第三種方法是斯坦福大學(xué)研制的接觸式點(diǎn)涂法。在DNA芯片制備中通過高速精密機(jī)械手的精確移動(dòng)讓移液頭與玻璃芯片接觸，而將DNA探針涂敷在芯片上。第四種方法是通過使用4支分別裝有A，T，G，C核昔的壓電噴頭在芯片上并行地合成出DNA探針。
光引導(dǎo)合成法與噴墨打印法、合成點(diǎn)樣法相比，最大的優(yōu)點(diǎn)是，它可以合成密度極高的陣列；但它的最大缺點(diǎn)是耗時(shí)、操作復(fù)雜，而且為保證在不同位點(diǎn)加上不同的單體，從而在不同的位點(diǎn)合成不同的探針，需要不斷更換不同的蔽光膜，對(duì)一個(gè)含25個(gè)堿基的探針的微陣列，一般需更換100個(gè)蔽光膜，需一天多的時(shí)間才能完成。合成點(diǎn)樣法雖然芯片上探針的密度相對(duì)較低，每個(gè)樣品都要預(yù)合成、純化，在芯片制備前還需妥善保存合成的探針，但是它的最大優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)便。目前很多公司采用這種方法來制備芯片。

2、樣品制備技術(shù)
生物樣品往往是各種組分的混合體，成分非常復(fù)雜，由于目前的檢測(cè)體系還不能檢測(cè)出未擴(kuò)增的標(biāo)記樣品，所以待測(cè)樣品DNA在雜交前一般都要進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)，在擴(kuò)增的過程中，對(duì)靶DNA進(jìn)行標(biāo)記。目前DNA樣品的擴(kuò)增一般是通過液相反應(yīng)來完成，但由于低濃度核酸很難檢測(cè)到，在溶液中通過PCR反應(yīng)獲得線性擴(kuò)增也很困難；另外，不同靶DNA對(duì)引物的競(jìng)爭(zhēng)，意味著某一序列的擴(kuò)增優(yōu)于其他序列。為了解決上述問題，一些公司正在研究新的方法。如固相PCR系統(tǒng)，該系統(tǒng)是將2種引物排列在丙烯酰胺膜上，與DNA樣品、PCR試劑混合，如樣品含有靶序列，則開始擴(kuò)增反應(yīng)；通過這種固相PCR體系，可避免對(duì)引物的競(jìng)爭(zhēng)，同時(shí)也降低了遺留污染。不過也有不少人試圖繞過樣品擴(kuò)增這一問題，如 Mosaic Technologies 公司引入的固相 PCR 方法，引物特異性強(qiáng)，無交叉污染并且省去了液相處理的煩瑣； Lynx Therapeutics 公司引入的大規(guī)模并行固相克隆法 (Massively parallel solid-phase cloning) ，可在一個(gè)樣品中同時(shí)對(duì)數(shù)以萬計(jì)的 DNA 片段進(jìn)行克隆，且無需單獨(dú)處理和分離每個(gè)克隆。
在芯片飛速發(fā)展的今天，樣品制備已經(jīng)成為芯片發(fā)展的瓶頸所在。對(duì)于較大規(guī)模制作芯片的用戶，由于點(diǎn)樣樣品數(shù)目太多，即使采用高通量試劑盒還是不夠方便。世界上聲譽(yù)卓著的核酸純化供應(yīng)商德國(guó)QIAGEN公司推出了全自動(dòng)核酸和蛋白純化工作站，該工作站有4個(gè)不同的自動(dòng)純化系統(tǒng)型號(hào)：BioRobot 8000，BioRobot 3000，BioRobot 9604，BioRobot 9600，加上QIAGEN優(yōu)質(zhì)的多種配套純化試劑盒--從質(zhì)粒、粘粒、RNA、血液基因組DNA、病毒DNA到蛋白，品種豐富，在歐美的生物醫(yī)學(xué)市場(chǎng)上掀起了一場(chǎng)革命，各大分子生物學(xué)中心、芯片中心、醫(yī)學(xué)中心爭(zhēng)相搶購(gòu)。
樣品獲得后要進(jìn)行標(biāo)記，目前樣品的標(biāo)記主要是熒光標(biāo)記。熒光標(biāo)記基本分為2種，一種是使用熒光標(biāo)記的引物，一種是使用熒光標(biāo)記的三磷酸脫氧核糖核苷酸。目前常使用的熒光物質(zhì)有：熒光素、羅丹明、HEX、TMR、FAM、Cy3、Cy5等。根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物分離的方法不同，標(biāo)記的方法也不同：進(jìn)行單引物標(biāo)記的，其擴(kuò)增產(chǎn)物通常由聚丙烯酰胺凝膠電泳分離；對(duì)一個(gè)引物用生物素標(biāo)記，另一個(gè)引物用熒光素標(biāo)記的，一般用親合素偶聯(lián)的磁珠捕捉其擴(kuò)增產(chǎn)物，通過變性處理使熒光標(biāo)記的產(chǎn)物解鏈。此外，也有用生物素殘基標(biāo)記引物，將生物素標(biāo)記的擴(kuò)增產(chǎn)物與芯片雜交，洗滌后加入親合素連接的熒光物，通過生物素與親合素的結(jié)合及靶序列與探針的結(jié)合產(chǎn)生熒光信號(hào)，然后利用熒光檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)熒光信號(hào)進(jìn)行檢測(cè)。

3、芯片點(diǎn)樣技術(shù)
點(diǎn)樣法是將預(yù)先通過液相化學(xué)大量合成好的探針、或PCR技術(shù)擴(kuò)增cDNA或基因組DNA經(jīng)純化、定量分析后，通過由陣列復(fù)制器（arraying and replicating device，ARD）或陣列點(diǎn)樣機(jī)（arrayer）及電腦控制的機(jī)器人，準(zhǔn)確、快速地將不同探針樣品定量點(diǎn)樣于帶正電荷的尼龍膜或硅片等相應(yīng)位置上（支持物應(yīng)事先進(jìn)行特定處理，例如包被以帶正電荷的多聚賴酸或氨基硅烷），再由紫外線交聯(lián)固定后即得到DNA微陣列或芯片。
點(diǎn)樣的方式分兩種，其一為接觸式點(diǎn)樣，即點(diǎn)樣針直接與固相支持物表面接觸，將DNA樣品留在固相支持物上；其二為非接觸式點(diǎn)樣，即噴點(diǎn)，它是以壓電原理將DNA樣品通過毛細(xì)管直接噴至固相支持物表面。打印法的優(yōu)點(diǎn)是探針密度高，通常1平方厘米可打印2,500個(gè)探針；缺點(diǎn)是定量準(zhǔn)確性及重現(xiàn)性不好，打印針易堵塞且使用壽命有限。噴印法的優(yōu)點(diǎn)是定量準(zhǔn)確，重現(xiàn)性好，使用壽命長(zhǎng)；缺點(diǎn)是噴印的斑點(diǎn)大，因此探針密度低，通常只有1平方厘米400點(diǎn)。點(diǎn)樣機(jī)器人有一套計(jì)算機(jī)控制三維移動(dòng)裝置、多個(gè)打印/噴印頭、一個(gè)減震底座，上面可放內(nèi)盛探針的多孔板和多個(gè)芯片。根據(jù)需要還可以有溫度和濕度控制裝置、針洗滌裝置。打印/噴印針將探針從多孔板取出直接打印或噴印于芯片上。
現(xiàn)在已經(jīng)有比較成型的點(diǎn)樣裝置出售，例如美國(guó)Biodot公司的“噴印”儀，以及Cartesian Technologies公司的Pix-Sys NQ/PA系列“打印”儀。這些自動(dòng)化儀器依據(jù)所配備的“打印”或“噴印”針將生物大分子從多孔板吸出直接“打印”或“噴印”于芯片片基上�！按蛴　睍r(shí)針頭與芯片片基表面發(fā)生接觸而“噴印”時(shí)針頭與片基表面保持一定的距離。所以，“打印”儀適宜制作較高密度的微陣列（例如2500點(diǎn)/cm2），“噴印”法由于“噴印”的斑點(diǎn)較大，所以只能形成較低密度的探針陣列，通常400點(diǎn)/cm2。點(diǎn)樣法制作芯片的工藝比較簡(jiǎn)單便于掌握、分析設(shè)備易于獲取，適宜用戶按照自己的需要靈活機(jī)動(dòng)地設(shè)計(jì)微點(diǎn)陣，用于科研和實(shí)踐工作。目前，除了在生物芯片研制方面享有盛譽(yù)的Affymetrix公司等個(gè)別公司使用原位合成技術(shù)制造芯片外，大多中小型公司普遍采用點(diǎn)樣技術(shù)制作生物芯片。

4、探針的制備技術(shù)
探針（探針的功能是識(shí)別靶序列和攜帶報(bào)告分子（如同位素、熒光、地高辛等））：為了提高監(jiān)測(cè)靈敏度，人們的努力放在信號(hào)放大以及模板擴(kuò)增兩個(gè)方面，其中應(yīng)用經(jīng)過特殊處理的探針方法可以提高靈敏度的方法有三種：分支探針這種方法的原理是，設(shè)計(jì)具有龐大分支結(jié)構(gòu)的分支核苷酸探針，分支末端以酶標(biāo)記。這樣，經(jīng)過分支核苷酸與酶的雙重放大作用而將標(biāo)本雜交時(shí)極弱的信號(hào)轉(zhuǎn)換為較強(qiáng)的化學(xué)信號(hào)。）、分子信標(biāo)（Molecular beacon, MB，一種設(shè)計(jì)巧妙的熒光標(biāo)記的核酸探針，未雜交狀態(tài)下為發(fā)夾結(jié)構(gòu)，在發(fā)夾的兩端分別連接熒光素分子和猝滅分子，利用熒光共振能量轉(zhuǎn)移原理（FRET））、肽核酸（Peptide nucleic acids, PNA，以中性酰胺鍵為骨架，不帶電荷，為DNA類似物。與DNA的親和性高、酶解穩(wěn)定性好，因此多用來做診斷和檢測(cè)用探針）探針3項(xiàng)技術(shù)。

5、雜交反應(yīng)及過程控制技術(shù)
芯片雜交是DNA芯片技術(shù)中除DNA方陣構(gòu)建外最重要的一步。雜交時(shí)選擇的條件要使成千上萬對(duì)的雜交反應(yīng)中的最大多數(shù)處于最佳狀態(tài)中，也就是說要使得盡可能多的正確配對(duì)物都不遺漏（假陰性盡可能少），有錯(cuò)配的雜交降低至最低（假陽性盡量少），這是非常難以達(dá)到的境界。
目前雜交是提高芯片在實(shí)際應(yīng)用中的準(zhǔn)確性的關(guān)鍵步驟之一。雜交條件的構(gòu)建要根據(jù)芯片的實(shí)際情況進(jìn)行最優(yōu)化。
雜交反應(yīng)是一個(gè)復(fù)雜的過程，受很多因素的影響，而雜交反應(yīng)的質(zhì)量和效率直接關(guān)系到檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。這些影響因素包括：（1）寡核苷酸探針密度的影響。低覆蓋率使雜交信號(hào)減弱，而過高的覆蓋率會(huì)造成相鄰探針之間的雜交干擾。（2）支持介質(zhì)與雜交序列間的間隔序列長(zhǎng)度的影響。研究表明當(dāng)間隔序列長(zhǎng)度提高到15個(gè)寡核苷酸時(shí)雜交信號(hào)顯著增強(qiáng)。有研究表明，選擇合適長(zhǎng)度的間隔序列，可使雜交信號(hào)增強(qiáng)150倍。（3）雜交序列長(zhǎng)度的影響。在雜交反應(yīng)中經(jīng)常發(fā)生堿基錯(cuò)配現(xiàn)象，區(qū)分正常配對(duì)的互補(bǔ)復(fù)合物與單個(gè)或2個(gè)堿基的錯(cuò)配形成的復(fù)合物，主要依賴于形成的復(fù)合物的穩(wěn)定性不同，而雜交序列的長(zhǎng)度是影響復(fù)合物穩(wěn)定性的一個(gè)重要因素，一般說來，短的雜交序列更容易區(qū)分堿基的錯(cuò)配，但復(fù)合物的穩(wěn)定性要差一些；而長(zhǎng)雜交序列形成的復(fù)合物穩(wěn)定，而區(qū)分堿基錯(cuò)配能力要差一些。研究表明，12、15、20個(gè)堿基產(chǎn)生的雜交信號(hào)強(qiáng)度接近，但15個(gè)堿基的雜交序列區(qū)分錯(cuò)配堿基效果最好。（4）GC含量的影響。GC含量不同的序列其復(fù)合物的穩(wěn)定性也不同。（5）探針濃度的影響。以凝膠為支持介質(zhì)的芯片，提高了寡核苷酸的濃度，在膠內(nèi)進(jìn)行的雜交更象在液相中進(jìn)行的雜交反應(yīng)，這些因素提高了對(duì)錯(cuò)配堿基的分辨率，同時(shí)也提高了芯片檢測(cè)的靈敏度。（6）核酸二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響。在使用凝膠作為支持介質(zhì)時(shí)，單鏈核酸越長(zhǎng)，則樣品進(jìn)入凝膠單元的時(shí)間越長(zhǎng)，也就越容易形成鏈內(nèi)二級(jí)結(jié)構(gòu)從而影響其與芯片上探針的雜交，因而樣品制備過程中，對(duì)核酸的片段化處理，不僅可提高雜交信號(hào)的強(qiáng)度，還可提高雜交速度。

6、雜交圖譜的信號(hào)檢測(cè)技術(shù)
雜交圖譜的信號(hào)檢測(cè)是生物芯片的兩個(gè)關(guān)鍵技術(shù)之一，目前關(guān)于芯片的大量專利和研究集中在這方面。熒光檢測(cè)主要有2種：激光共聚焦熒光顯微掃描和CCD熒光顯微照相檢測(cè)。前者檢測(cè)靈敏度、分辨率均較高，但掃描時(shí)間長(zhǎng)；后者掃描時(shí)間短，但靈敏度和分辨率不如前者。雖然熒光檢測(cè)在芯片技術(shù)中得到了廣泛的應(yīng)用，但是熒光標(biāo)記的靶DNA只要結(jié)合到芯片上就會(huì)產(chǎn)生熒光信號(hào)，而目前的檢測(cè)系統(tǒng)還不能區(qū)分來自某一位點(diǎn)的熒光信號(hào)是由正常配對(duì)產(chǎn)生的，還是單個(gè)或2個(gè)堿基的錯(cuò)配產(chǎn)生的，或者兼而有之，甚或是由非特異性吸附產(chǎn)生的，因而目前的熒光檢測(cè)系統(tǒng)還有待于進(jìn)一步完善與發(fā)展。有研究者正試圖繞過熒光標(biāo)記，建立新的檢測(cè)系統(tǒng)，以提高雜交信號(hào)檢測(cè)的靈敏度。

比較成熟的是采用激光系統(tǒng)掃描儀進(jìn)行的熒光檢測(cè)，噪音水平、信噪比、分辨率是衡量掃描儀工作質(zhì)量的幾個(gè)重要指標(biāo)。由于熒光標(biāo)記法的靈敏度相對(duì)較低，因此質(zhì)譜法、化學(xué)發(fā)光和光導(dǎo)纖維、二極管方陣檢測(cè)、乳膠凝集反應(yīng)、直接電荷變化檢測(cè)等等正作為新的芯片標(biāo)記和檢測(cè)方法處于研究和試驗(yàn)階段，其中最有前途的當(dāng)推質(zhì)譜法。
目前有很多廠商生產(chǎn)生物芯片信號(hào)檢測(cè)掃描儀，知名的公司包括：Genomic Solutions公司、Packard公司、GSI公司、Molecular Dynamics、Genetic