蛋白芯片的基本原理及技術(shù)研究現(xiàn)狀

作者：陳瑋瑩 來(lái)源：《國(guó)外醫(yī)學(xué)臨床生物化學(xué)及檢驗(yàn)學(xué)分冊(cè)》
汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院 陳瑋瑩 綜述 溫博貴

隨著分子生物學(xué)芯片技術(shù)研究工作的進(jìn)一步深入開展，NDA芯片技術(shù)已經(jīng)被逐漸應(yīng)用于對(duì)生物樣品中的各種已知或未知的核酸序列表達(dá)的檢測(cè)和比較研究。但是，作為生物體細(xì)胞中實(shí)施化學(xué)反應(yīng)功能成分的蛋白質(zhì)，其相當(dāng)部分與活性基因所表達(dá)的mRNA之間未能顯示出直接的關(guān)系，因此使作為高通量基因表達(dá)分析平臺(tái)的cDNA芯片技術(shù)的應(yīng)用過程受到一定的限制。另外，由于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和構(gòu)象方面的各種微小的化學(xué)變化均能引起活性或功能的改變，為了進(jìn)一步揭示細(xì)胞內(nèi)各種代謝過程與蛋白質(zhì)之間的關(guān)系以及某些疾病發(fā)生的分子機(jī)理，必須對(duì)蛋白質(zhì)的功能進(jìn)行更深入的研究。隨著DNA芯片技術(shù)的不斷成熟以及基因研究所取得的令人矚目的成果，進(jìn)一步推動(dòng)了蛋白質(zhì)功能的研究及其相關(guān)技術(shù)的發(fā)展，蛋白芯片技術(shù)也就應(yīng)運(yùn)而生。本文擬對(duì)蛋白芯片的基本原理、相應(yīng)技術(shù)研究的概況和存在問題進(jìn)行綜述。

1 蛋白芯片技術(shù)的基本原理
蛋白芯片技術(shù)的基本原理是將各種蛋白質(zhì)有序地固定于滴定板、濾膜和載玻片等各種載體上成為檢測(cè)用的芯片，然后，用標(biāo)記了特定熒光抗菌素體的蛋白質(zhì)或其他成分與芯片作用，經(jīng)漂將未能與芯片上的蛋白質(zhì)互補(bǔ)結(jié)合的成分洗去，再利用熒光掃描儀或激光共聚焦掃描技術(shù)，測(cè)定芯片上各點(diǎn)的熒光強(qiáng)度，通過熒光強(qiáng)度分析蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間相互作用的關(guān)系，由此達(dá)到測(cè)定各種蛋白質(zhì)功能的目的。為了實(shí)現(xiàn)這個(gè)目的，首先必須通過一定的方法將蛋白質(zhì)固定于合適的體上，同時(shí)能夠維持蛋白質(zhì)天然構(gòu)象，也就是必須防止其變性以維持其原有特定的生物活性。另外，由于生物細(xì)胞中蛋白質(zhì)的多樣性和功能的復(fù)雜性，開發(fā)和建立具有多樣品并行處理能力、能夠進(jìn)行快速分析的高通量蛋白芯處技術(shù)將有利于簡(jiǎn)化和加快蛋白質(zhì)功能研究的進(jìn)展。

2 蛋白芯片技術(shù)的研究現(xiàn)狀
在多年的蛋白芯片技術(shù)的研究過程中，研究者為了尋找合適的物質(zhì)作為蛋白的載體進(jìn)行了不懈的探索。例如日本學(xué)者Velev利用含有陽(yáng)離子表面活性劑（HTAB）脂質(zhì)體作為載體，通過戊二醛作用使其與一種鐵蛋白包裹外殼的成分結(jié)合組裝制備成為一種納米水平的裝配體，這種裝配體可以在適當(dāng)?shù)膒H條件下，使鐵蛋白分子進(jìn)入并固定于包裹外殼內(nèi)面，形成蛋白質(zhì)的載體。Adachi等利用某些固體表面或薄膜覆蓋上含有電解質(zhì)的薄膜作為載體，可以將膠體蛋白質(zhì)顆粒成分轉(zhuǎn)移至薄膜上形成蛋白芯片。Uetz等在分析啤酒酵母基因組序列全長(zhǎng)度閱讀框架編碼各種蛋白質(zhì)的相互作用的過程，使用不同孔數(shù)的平板作為載體，建立了約含有6000個(gè)酵母轉(zhuǎn)化株組成的平板蛋白芯片系統(tǒng)，平板上的每一個(gè)小孔中含有一個(gè)酵母轉(zhuǎn)化株，可以根據(jù)其活性功能區(qū)開放閱讀框架的編碼表達(dá)生成一種蛋白質(zhì)，利用這個(gè)系統(tǒng)可以用于蛋白質(zhì)功能的檢測(cè)和分析。Arenkov等利用聚丙烯酰胺凝膠板作為支持物，將蛋白樣品置于凝膠上，然后經(jīng)過電泳分離，使其成為蛋白的陣列用于進(jìn)一步的研究。最近，哈佛大學(xué)蛋白芯片研究中心Gavin等利用制備DNA芯片的高精密度機(jī)械手的針狀點(diǎn)樣槍頭在只有顯微鏡載玻片一半大小的玻片上，制備了第一張含有樣品點(diǎn)數(shù)為10800的蛋白芯片。這張芯片用已純化的蛋白，G按每點(diǎn)為1納升的點(diǎn)樣量點(diǎn)樣10799次，另一次用FRB(FK-BR12-rapamycin binding domain of FKBP-rapamycin-associated protein)點(diǎn)樣。為了確保不同分子量 的點(diǎn)樣蛋白質(zhì)都能夠被固定在玻片上，他們首先在玻片表面涂上BSA,然后使用N,N’-二琥珀酰胺碳酸（N,N,-disuccinimidyl carbonate）激活BSA表面的賴氨酸、天冬氨酸和谷氨酸殘基成為BSA-NHS玻片，其作用是促進(jìn)BSA與點(diǎn)樣蛋白質(zhì)的結(jié)合而使蛋白質(zhì)被固定于玻片上。在制備芯片過程中，為了保證被固定在載體上的蛋白質(zhì)依然保持天然的構(gòu)象和生物學(xué)活性，他們?cè)诘鞍踪|(zhì)點(diǎn)樣的磷酸鹽緩沖液中加入40%的甘油，以防止因體的蒸發(fā)而造成的蛋白質(zhì)變性。點(diǎn)樣后再經(jīng)3h的溫浴并將零片浸泡于含有小牛血清蛋白（BSA）的緩沖液中，使芯片表面含有一層小牛血清蛋白，用于封閉與其他蛋白質(zhì)產(chǎn)生非特異性結(jié)合的部位及在表面未參加反應(yīng)的醛基。為了檢測(cè)芯片的應(yīng)用，他們用不同熒光抗體分別標(biāo)記能與蛋白G和FRB特異結(jié)合的IgG和FKBP12（12Kd FK506-binding protein）并作用于蛋白芯片，觀察這些蛋白質(zhì)與蛋白芯片的相互作用，其結(jié)果清晰地顯示芯片上的蛋白G和單一的FRB點(diǎn)樣分別被標(biāo)上藍(lán)色和紅色熒光。該實(shí)驗(yàn)研究建立了蛋白質(zhì)樣品微量點(diǎn)樣技術(shù)并使蛋白質(zhì)固定于載體上時(shí)能夠保留原有的構(gòu)象和生物學(xué)活性，這將為今后對(duì)蛋白質(zhì)多樣品的并行研究或快速分析——為制備高通量功能檢測(cè)的蛋白芯片奠定了技術(shù)基礎(chǔ)。

3 蛋白芯片的應(yīng)用研究
目前，學(xué)者們正在開展有關(guān)蛋白芯片技術(shù)應(yīng)用的研究，Holt等利用蛋白芯片技術(shù)篩選能夠相互結(jié)合的特異抗體抗原成分，他們利用12種表達(dá)較強(qiáng)但尚未接觸任何抗原的抗體片段篩選含有27648種人胎腦蛋白的蛋白芯片，從中找出了4組高度特異性的抗原（蛋白）-抗體復(fù)合物，其中有3種抗體結(jié)合的蛋白質(zhì)功能未明，但是由于表達(dá)水平都較低，說明這種抗原-抗體的結(jié)合技術(shù)是一種具有較高特異性和敏感性的篩選方法，可以用于高通量篩選分離各種不同的抗體成分，或檢測(cè)基因的表達(dá)和蛋白分子間的相互作用，這將有助于對(duì)某些疾�。ò�括腫瘤）的發(fā)病分子機(jī)理的研究，以及協(xié)助尋找疾病診斷和治療的靶分子。根據(jù)蛋白芯片技術(shù)的基本原理，可以將不同的抗體固定于載體上成為抗體蛋白芯片，用于檢測(cè)不同組織產(chǎn)生的蛋白質(zhì)。

Ge在蛋白質(zhì)的相互作用的研究中，采用了一種通用的蛋白質(zhì)芯片系統(tǒng)，該系統(tǒng)敏感有效，用途廣泛，可定量測(cè)定及重復(fù)使用，而且操作簡(jiǎn)易。Gavin等應(yīng)用蛋白芯片技術(shù)觀察代謝過程有關(guān)作用物和酶的相互作用關(guān)系。他們選擇三對(duì)沒的激酶-作用物系統(tǒng)，即依賴3’，5’-磷酸蛋白激酶-Kemptide; 酷蛋白激酶Ⅱ-蛋白質(zhì)磷酸酶抑制因子2和p42促有絲分裂劑激活蛋白（MAP）激酶（ErK2）-E1K1,首先將各系統(tǒng)的作用物按順序固定于三張BSA-NHS玻片上，分別在有同位素γ-³³P ATP的環(huán)境中，與不同蛋白激酶溫浴，然后，玻片經(jīng)用乳劑處理后可在光鏡下觀察到各種蛋白激酶催化特異的作用物產(chǎn)生磷酸化反應(yīng)。其結(jié)果提示蛋白芯片技術(shù)可以應(yīng)用于作用物與酶相互作用的研究及代謝機(jī)制的分析。Gavin等還在蛋白芯片技術(shù)研究過程通過DIG、生物素和合成的六氫吡喧酮胺（即AP1497）等三種具有對(duì)應(yīng)的蛋白受體的小分子特質(zhì)，研究蛋白的受體蛋白按順序固定的相互作用。他們首先將三種小分子物質(zhì)的受體蛋白按順序固定于同一載體上并制備成為相同的四張蛋白芯片，將BSA分別用沒的熒光物質(zhì)（Alexa488、Cy3，或Cy5）標(biāo)記，并分與DIC、生物素和AP1497三種小分子物質(zhì)結(jié)合成為探針，用每一種具有不同熒光標(biāo)記的探針作用地芯片，結(jié)果只能有能與小分子對(duì)應(yīng)的受體蛋白被標(biāo)上熒光。上述結(jié)果說明使用的熒光劑之間沒有交叉的熒光激發(fā)和發(fā)光作用，因此，將三種標(biāo)記探針混合后作用于蛋白芯片，則可使三種不同的受體蛋白同時(shí)標(biāo)記上不同的熒光。研究結(jié)果提示蛋白芯片技術(shù)對(duì)于新藥的發(fā)掘是十分有用的，因?yàn)樗鼘?duì)尋找新藥作用的靶點(diǎn)非常方便。

4 存在的問題及應(yīng)用前景
雖然目前已經(jīng)成功地制出了第一張具有高通量分析平參作用的蛋白芯片，通過適當(dāng)?shù)募夹g(shù)處理可以使點(diǎn)樣蛋白保持天然的構(gòu)象和生物學(xué)活性。但是，利用蛋白芯片技術(shù)對(duì)于蛋白質(zhì)功能的研究仍然存在著種種問題，例如目前大多數(shù)來(lái)自于cD-NA文庫(kù)的克隆體系不能通過正確的閱讀框架編碼蛋白質(zhì);或者不能正確表達(dá)產(chǎn)生具有氨基酸全序列的蛋白分子；通過細(xì)菌表達(dá)的蛋白質(zhì)不能形成正常的空間構(gòu)象等，都將直接影響有關(guān)蛋白質(zhì)功能的研究。另外，為了方便種類繁多的蛋白質(zhì)的功能檢測(cè)和分析，通過不同途徑或方式獲取并用于制作蛋白芯片的蛋白質(zhì)必須首先經(jīng)過純化。正常和異常情況下蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的相互作用的差別都需要我們進(jìn)一步去探索。

綜上所述，高通量分析平臺(tái)蛋白芯片技術(shù)的建立將為蛋白質(zhì)功能及其相關(guān)的研究提供快速、高信息量和更為直接的研究方法，與其他的分子生物學(xué)分析方法相比，蛋白芯片技術(shù)具有快速、平行的優(yōu)越性。該方法的建立和應(yīng)用將有助于人類揭示疾病發(fā)生的分子機(jī)制及尋找更為合理有效的治療手段和途徑。迄今為止，這一嶄新的技術(shù)仍存在一些缺陷，有待進(jìn)一步完善和發(fā)展。