DPI技術(shù)－“分子顯微鏡”

DPI（Dual Polarization Interferometry）雙偏振極化干涉分析技術(shù)是自2002年以后發(fā)展起來(lái)的用于對(duì)相互作用的分子之間的實(shí)時(shí)相互作用行為進(jìn)行定性定量測(cè)量研究的工具。通過(guò)對(duì)兩相或者多相分子相互作用界面層的的密度、厚度和表面濃度進(jìn)行實(shí)時(shí)的、動(dòng)態(tài)的定量測(cè)量來(lái)了解分子結(jié)構(gòu)（如聚合物或表活劑分子）與界面相互作用（如吸附）行為之間的關(guān)系。DPI技術(shù)廣泛應(yīng)用于日化和精細(xì)化工、蛋白質(zhì)與藥物研發(fā)、生物物理等研究領(lǐng)域。實(shí)時(shí)分析測(cè)量的另外一個(gè)優(yōu)勢(shì)在于可以對(duì)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行實(shí)時(shí)優(yōu)化，在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中可以隨時(shí)改變實(shí)驗(yàn)條件如PH值、外來(lái)添加劑分子的疏水/親水強(qiáng)度、極性等等，能夠?qū)崟r(shí)觀察分子間相互作用強(qiáng)度和界面相互作用的變化。

DPI技術(shù)的原理

雙偏振極化干涉測(cè)量分析系統(tǒng)的理論基礎(chǔ)為200年前Thomas Yuong的干涉實(shí)驗(yàn)，如圖，當(dāng)光源通過(guò)相鄰的兩道狹縫后會(huì)在狹縫后面發(fā)生干涉，在某一聚焦平面上產(chǎn)生明暗的條紋，同樣如果用兩片平板光導(dǎo)介質(zhì)代替兩個(gè)狹縫，光源發(fā)出的光便會(huì)在通過(guò)光導(dǎo)介質(zhì)后產(chǎn)生干涉條紋，用適當(dāng)?shù)墓鈾z測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)可得到動(dòng)態(tài)的干涉變化。

當(dāng)用物理或者化學(xué)的方法將被測(cè)樣品（如蛋白質(zhì)或表面活性劑等）吸附在其中某一個(gè)光導(dǎo)界面上后，將另外一種液相物質(zhì)（如金屬離子或者藥物小分子等）流經(jīng)被測(cè)物表面時(shí)，兩相分子之間會(huì)產(chǎn)生相互作用，當(dāng)特異性作用發(fā)生時(shí)，干涉光譜會(huì)有明顯變化，通過(guò)監(jiān)測(cè)干涉光譜的變化實(shí)時(shí)檢測(cè)被測(cè)物質(zhì)與其它小分子相互作用時(shí)的被測(cè)物質(zhì)的空間構(gòu)象實(shí)時(shí)變化以及相應(yīng)熱力學(xué)及動(dòng)力學(xué)參數(shù)的變化。見(jiàn)下圖：

DPI技術(shù)的最大特色是高分辨率的實(shí)時(shí)定量測(cè)量技術(shù)，它不僅給出相互作用的動(dòng)力學(xué)及熱力學(xué)參數(shù)，來(lái)判定特異性的結(jié)合，而且給出在相互作用時(shí)被測(cè)物分子的空間構(gòu)型變化，密度、厚度、質(zhì)量的變化；以及在外界因素影響下，被測(cè)物自身的分子空間構(gòu)型變化，如蛋白質(zhì)在不同PH值或者不同濃度的金屬離子環(huán)境中分子空間構(gòu)象變化或自身聚集情況的定量測(cè)量，用來(lái)篩選影響蛋白聚集的外界因素等。DPI技術(shù)可以實(shí)施測(cè)量到分子<0.1A的空間構(gòu)象（尺寸）的變化，以及<0.1pg/mm³ 的密度變化，可以檢測(cè)到分子量為100000Da的生物大分子上結(jié)合的質(zhì)量<50Da的小分子中，分辨率為5Da的質(zhì)量變化。

DPI技術(shù)在生物、醫(yī)學(xué)、材料科學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用

DPI技術(shù)的商品化儀器，英國(guó)Farfield公司的AnaLight系列分析系統(tǒng)已經(jīng)成功應(yīng)用于生物物理學(xué)包括蛋白質(zhì)、核酸、脂、糖類(lèi)等生物大分子的研究。作為干涉測(cè)量技術(shù)，DPI具有極寬的動(dòng)態(tài)范圍，可選擇使用的化學(xué)試劑范圍寬，如DMSO、EtOH和各種緩沖溶液添加劑，與其它技術(shù)相比，DPI可以使用戶(hù)隨意選擇試劑及緩沖溶液來(lái)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。 DPI技術(shù)對(duì)于研究人員找出生物大分子結(jié)構(gòu)變化與功能之間的關(guān)系，以及生物大分子與其它小分子間相互作用的實(shí)時(shí)檢測(cè)是目前所有的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)無(wú)法實(shí)現(xiàn)的。
其在蛋白質(zhì)學(xué)領(lǐng)域研究的主要應(yīng)用有⑴生物大分子間相互作用；⑵膜蛋白與膜脂研究；⑶蛋白與小分子（藥物）相互作用，藥物研發(fā)篩選；⑷蛋白與金屬離子間相互作用；⑸生物大分子結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性研究；⑹蛋白質(zhì)結(jié)晶研究等領(lǐng)域。
例如，DPI技術(shù)可以對(duì)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)表征，及其在固-液界面上的吸附、聚集行為進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，對(duì)分子結(jié)合過(guò)程進(jìn)行化學(xué)計(jì)量，并區(qū)分特異性和非特異性結(jié)合。小分子和固定化蛋白質(zhì)之間的相互作用一直是醫(yī)藥領(lǐng)域關(guān)注的熱點(diǎn)，在d-生物素和固定化抗生物素蛋白鏈菌素相互作用的經(jīng)典模型中，DPI技術(shù)給出了固定化抗生物素蛋白鏈菌素層在溶液中與d-生物素結(jié)合相互作用的密度、厚度的實(shí)時(shí)變化，實(shí)驗(yàn)所得的分子結(jié)構(gòu)演變數(shù)據(jù)與x-晶體衍射實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)高度吻合，結(jié)合d-生物素后的質(zhì)量變化也與預(yù)期的結(jié)合容量一致。蛋白吸附層的密度變化可以提供關(guān)于特異性非特異性結(jié)合相互作用的信息。
美國(guó)科學(xué)家們利用DPI技術(shù)表征碳水化合物—蛋白質(zhì)相互作用，所選實(shí)驗(yàn)材料包括一個(gè)12 kDa的重組的膠原蛋白V（ HepV）和肝素的片段，一個(gè)復(fù)雜的多糖。該分析報(bào)告包括HepV片段與肝素結(jié)合時(shí)分子層的厚度、密度和表面結(jié)構(gòu)。對(duì)于硫酸乙酰肝素表面硫酸根基團(tuán)和蛋白質(zhì)結(jié)合區(qū)域來(lái)說(shuō)是一個(gè)非常有價(jià)值的研究模型。該模型已初步研究了其生物的相關(guān)性，反應(yīng)動(dòng)力學(xué)研究結(jié)果與用表面等離子體共振（ SPR ）檢測(cè)結(jié)果相似，已歸因于假定的構(gòu)象變化。 同時(shí)，采用DPI技術(shù)，一個(gè)抗生物素蛋白鏈菌素層（表面覆蓋率為2.105 ng/mm² ）被固定到傳感器的表面（92 ％），捕獲的生物素結(jié)合肝素為0.105 ng/mm²（化學(xué)計(jì)量比為1：6），肝素與抗生物素蛋白鏈菌素結(jié)合，但仍有能力結(jié)合0.154 ng/mm² HepV，這使得重組膠原蛋白V和肝素復(fù)合物化學(xué)計(jì)量比（1.7:1.0 ）的計(jì)算結(jié)果顯得可靠 ，這些通過(guò)SPR檢測(cè)是難以評(píng)估的。此外，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)分析了肝素與HepV的相互作用，DPI結(jié)果顯示在結(jié)合發(fā)生時(shí)可能有一些表面的缺失（可能是抗生物素蛋白鏈菌素），而非僅僅動(dòng)力學(xué)基礎(chǔ)上假定的構(gòu)象變化，為進(jìn)一步的結(jié)合機(jī)制的研究提供了可能性。
丹麥科學(xué)家也曾對(duì)DPI與目前廣泛采用的SPR（表面等離子體共振）技術(shù)進(jìn)行比較，這兩種技術(shù)都是使用消逝波場(chǎng)作為感測(cè)元件，但計(jì)算吸收量的方法是完全不同的。測(cè)試系統(tǒng)采用脂肪酶和C-18表面的吸附作用。 這兩種技術(shù)對(duì)吸附量的計(jì)算結(jié)果是基本一致的，等溫吸附線均在脂肪酶濃度不低于1000 nM時(shí)于1.30～1.35mg/m ²達(dá)到飽和。這一研究結(jié)果支持了同時(shí)使用DPI和SPR技術(shù)作為研究蛋白吸附的工具，SPR技術(shù)的即時(shí)感應(yīng)適用于建立初步的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)研究，而DPI技術(shù)在吸附層折射率和厚度的化學(xué)計(jì)量方面精確度更勝一籌。
DPI技術(shù)在研究神經(jīng)衰退性疾病方面有很大發(fā)展空間。一些神經(jīng)衰退性疾病，包括老年癡呆癥和帕金森氏病等常與異蛋白聚集異常有關(guān)，這種異常是由蛋白質(zhì)的錯(cuò)誤折疊導(dǎo)致的，因此成為新藥研發(fā)中病因?qū)W研究的主要目標(biāo)。DPI技術(shù)可以準(zhǔn)確地測(cè)量蛋白的錯(cuò)誤折疊，因此提供了重要的洞察疾病發(fā)病機(jī)制中早期變化的工具，來(lái)發(fā)現(xiàn)甚至捕捉那些隱藏在緩慢、微妙的神經(jīng)系統(tǒng)衰退性變化背后的最早階段的蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊。
此外，DPI技術(shù)在表面科學(xué)分析和生物納米技術(shù)領(lǐng)域也有廣泛的應(yīng)用。 DPI分析系統(tǒng)通過(guò)實(shí)時(shí)定量測(cè)量各種薄膜和納米表面來(lái)研究其結(jié)構(gòu)和特點(diǎn)。DPI技術(shù)的商品化儀器 AnaLight系列，廣泛應(yīng)用于納米技術(shù)領(lǐng)域，包括聚合物，表面活性劑精細(xì)化工和生物大分子，如表面科學(xué)與界面研究（薄膜分析）； FMCG 研究開(kāi)發(fā)；納米技術(shù)及納米表面結(jié)構(gòu)；生物納米技術(shù)生物分子表面科學(xué)；生物適應(yīng)性、表面活性劑、聚合物等界面相互作用；界面物理化學(xué)、界面科學(xué)、洗脫研究；生物材料表面化學(xué)（如隱形眼鏡、體內(nèi)植入體等）；膠體表面化學(xué)中兩親分子有序組合體和分子自組裝研究研究等。
例如，英國(guó)科學(xué)家們采用DPI技術(shù)進(jìn)行了溶菌酶在硅膠/水界面的吸附作用的研究，該以實(shí)驗(yàn)室為基礎(chǔ)的技術(shù)允許在一個(gè)摻有微量二氧化硅（石英）的表面吸附或解吸附酶分子層，實(shí)時(shí)測(cè)量厚度和折射率隨時(shí)間的變化。研究了一系列濃度梯度（0.03～4.0 g/dm³）和pH梯度（4～7）的溶菌酶的吸附作用，如pH為4時(shí)逐漸增加酶分子濃度，吸附層厚度為14～ 43 ± 1 Å，覆蓋率為0.21 to 2.36 ± 0.05 mg/m²，單分子吸附層在低濃度酶液中顯示出強(qiáng)烈的變形以及構(gòu)型翻轉(zhuǎn)，當(dāng)pH為7時(shí)，吸附層厚度為16～ 54 ± 1 Å ，覆蓋率顯著增加為 (0.74 to 3.29 ± 0.05 mg/m³ ), 同樣顯示出隨著酶分子濃度增加，從最初單分子吸附層形成逐漸過(guò)渡到雙吸附層過(guò)程中酶分子結(jié)構(gòu)的變化。pH 值再循環(huán)顯示，酶濃度固定在1.0 g/dm³時(shí)有一個(gè)廣泛的可逆吸附范圍，且與pH值變化（4～7）無(wú)關(guān)。 盡管精妙的分子取向細(xì)節(jié)在吸附層上各不相同，這些觀察結(jié)果與前期采用中子反射法所得結(jié)果是一致的。
目前，在國(guó)內(nèi)大陸地區(qū)還未有該系列產(chǎn)品的應(yīng)用。由于其諸多無(wú)可比擬的優(yōu)點(diǎn)，DPI系統(tǒng)將會(huì)越來(lái)越廣泛地應(yīng)用在生物、醫(yī)學(xué)及材料科學(xué)方面。