蛋白質(zhì)組學(xué)入門(mén)問(wèn)題集錦

雙向電泳篇
1. 重泡脹后的膠可以不用轉(zhuǎn)移到另一個(gè)電泳槽，直接跑 2D 的一向嗎？
一般情況下是可以的。但當(dāng)上樣量特別大時(shí)，可能會(huì)有一部分蛋白質(zhì)沒(méi)有被膠條吸收，這樣跑完 1D 和 2D 膠后，會(huì)有很多橫向條紋。所以在這種情況下，最好在重泡脹后，將膠條轉(zhuǎn)移到另外一個(gè)電泳漕中進(jìn)行電泳。

2. 為什么我在等電聚焦前加的礦物油在聚焦后會(huì)減少，暴露出了膠條的背面？
這是因?yàn)?BioRad 的電泳槽有個(gè)蓋子。為了固定電泳槽中的膠條，這個(gè)蓋子上設(shè)計(jì)了對(duì)應(yīng)的突起，以便壓住膠條。由于虹吸作用，這個(gè)突起會(huì)導(dǎo)引礦物油到相鄰的空電泳槽，從而降低有膠條的電泳槽中的礦物油液面。如果由此把膠條暴露在空氣中，那對(duì)等電聚焦的影響將是毀滅性的。為了防止這個(gè)現(xiàn)象的發(fā)生，可以在相鄰的空電泳槽里，也加入適量（ 80 ％滿）的礦物油。

3. 跑第一向時(shí)，為什么要設(shè)定一個(gè)電流的最大值電壓(50 μ A/ 膠)？
電流的平方和功率成正比。電流增大，功率增大，放出的熱量也隨之增大，就會(huì)導(dǎo)致膠條的溫度增加。當(dāng)溫度超過(guò) 30 攝氏度時(shí)，緩沖液里的尿素就容易解離，產(chǎn)生一些極性分子，從而對(duì)等電聚焦產(chǎn)生影響。

4. 跑第一向時(shí)，為什么剛開(kāi)始的電壓比較低，而后逐漸增高？
剛開(kāi)始時(shí)，體系內(nèi)的帶電小分子比較多（比如無(wú)機(jī)鹽和雙極性分子）。所以在這個(gè)階段，電流主要是由這些小分子的移動(dòng)所產(chǎn)生的。由于這些分子質(zhì)量小，移動(dòng)他們不需要很高的電壓。當(dāng)這些小分子移動(dòng)到他們的目的地時(shí)（無(wú)機(jī)鹽移動(dòng)到極性相反的電極；兩性分子移動(dòng)到對(duì)應(yīng)的 pH 條帶），體系內(nèi)的蛋白質(zhì)才開(kāi)始肩負(fù)起運(yùn)載電流的任務(wù)，逐漸向所對(duì)應(yīng)的 pH 區(qū)域移動(dòng)。

5. 跑第一向時(shí)，為什么會(huì)產(chǎn)生一條藍(lán)色的條帶，并逐漸向酸性端移動(dòng)？
藍(lán)色條帶是緩沖液中痕量的溴酚藍(lán)被聚焦所產(chǎn)生的。溴酚藍(lán)也是 pH 指示劑，當(dāng)它移動(dòng)到酸性區(qū)時(shí)（ pH4 ），顏色會(huì)變成黃色。溴酚藍(lán)的這個(gè)移動(dòng)過(guò)程大體上發(fā)生在極性小分子的聚焦之后，蛋白質(zhì)大分子聚焦之前。

6. 跑第一向時(shí)，為什么電壓總達(dá)不到預(yù)定值？
當(dāng)上樣量比較大時(shí)或體系內(nèi)鹽分比較多時(shí)，聚焦的電壓有可能達(dá)不到所設(shè)定的數(shù)值。

7. 跑第一向時(shí)，在電壓達(dá)到預(yù)定值后，電流為什么會(huì)降低？
當(dāng)上樣量比較少時(shí)，所有蛋白在較短的時(shí)間內(nèi)就移動(dòng)到所對(duì)應(yīng)的 pH 值區(qū)域值，從而變成中性分子。這樣，體系的電阻越來(lái)越大，在恒定的電壓下，電流就會(huì)越來(lái)越小。

8. 跑第一向時(shí)，為什么在兩個(gè)電極絲附近有氣泡產(chǎn)生？
等電聚焦完成后，所有的蛋白質(zhì)都移動(dòng)到了相應(yīng)的 pI 值區(qū)域，而成為中心分子。這是加在體系上的電壓就開(kāi)始電解水分子，在陽(yáng)極產(chǎn)生氧氣，在陰極產(chǎn)生氫氣。

9. 重泡脹緩沖液(rehydration buffer)中的硫脲的作用是什么，雙極性分子的作用是什么？
硫脲的作用是增加蛋白質(zhì)的溶解性，特別是堿性蛋白的溶解性。雙極性分子的作用也是增加蛋白質(zhì)的溶解性。當(dāng)?shù)鞍滓苿?dòng)到相應(yīng)的 pH 值后，就變成了中性分子。而不帶電荷的蛋白質(zhì)分子容易聚集，從而降低其在隨后的二向膠時(shí)的遷移效率，可能會(huì)造成豎的脫尾。而硫脲和雙極性小分子則會(huì)鑒定中性蛋白質(zhì)之間的相互作用，防止它們的聚集。

10. 怎樣估計(jì) 2D 膠上蛋白質(zhì)點(diǎn)的分子量和 pI 值？
可以用 BioRad 生產(chǎn)的 2D 膠標(biāo)準(zhǔn)蛋白來(lái)校準(zhǔn)。也可以用體系內(nèi)已知蛋白來(lái)做比對(duì)。

11. 為什么 2D 膠上的蛋白點(diǎn)有橫的和豎的脫尾？
橫的脫尾可能是： 1 ）一向等電聚焦不完全； 2 ）某些蛋白質(zhì)本身的原因（糖蛋白）； 3 ）蛋白的豐度太高。豎的脫尾是因?yàn)榕芏�向時(shí)，蛋白的溶解度不好。

12. 什么成分會(huì)影響 2D 膠的效果？
核酸，鹽，去垢劑等等。

13. 2D 膠的上樣量應(yīng)該在什么范圍？
上樣量和樣品有關(guān)。樣品內(nèi)蛋白種類多的上樣量要大些，這樣每個(gè)點(diǎn)才有足夠的量被檢測(cè)到。一般的全細(xì)胞裂解體系，上樣量大概在 100 微克（銀染）到 500 微克（考染）之間。

14. 我的蛋白質(zhì)濃度很低，應(yīng)該用什么方法來(lái)濃縮？
蛋白質(zhì)的濃縮有很多方法。大致有超濾法，沉淀法和透析法。超濾比較溫和，對(duì)蛋白質(zhì)不會(huì)有修飾和改變，蛋白的種類一般不會(huì)有丟失。它的缺點(diǎn)是總樣品的量可能會(huì)減少（被膜所吸附）。另外超濾對(duì)樣品的要求比較高。甘油，去垢劑都會(huì)堵塞濾膜，影響超濾的效果。沉淀法比較快速，容易操作，對(duì)鹽，甘油，去垢劑的耐受性好。缺點(diǎn)是可能會(huì)有部分種類的蛋白沒(méi)有被沉淀下來(lái)（丟失）。沉淀法中，又以 TCA 法最為普遍使用。使用 TCA 法時(shí)，一定要用冷的純丙酮清洗蛋白沉淀兩次，去處殘留的 TCA 和其他沉淀下來(lái)的雜質(zhì)。透析法只使用于量比較大的樣品，量小時(shí)，操作困難。 透析法可以和超濾法聯(lián)用。先把樣品透析到一個(gè)比較干凈的環(huán)境（ 不含鹽，甘油，去垢劑或其它雜質(zhì)，比如碳酸氫氨溶液），然后再進(jìn)行超濾。

酶解篇
1. 用 Trypsin 酶解蛋白質(zhì)時(shí)，碳酸氫氨的濃度應(yīng)該是多少？
酶解時(shí)碳酸氫氨的濃度一般在 10 ～ 50 mM 之間。碳酸氫氨的作用主要是提供一個(gè)堿性的水解環(huán)境，因?yàn)?Typsin 的活力在 pH8 ～ 9 之間最高。最常用的碳酸氫氨濃度有 20 mM ， 40 mM 。鹽濃度過(guò)大時(shí)，后續(xù)的凍干過(guò)程中會(huì)有較多的鹽析出；鹽濃度過(guò)小時(shí)，則不能有效的提供堿性 pH 的水解環(huán)境（尤其是在樣品的 pH 值低，而且體積大時(shí)）。為了確定酶解體系的 pH 值，可以用

2. Trypsin 儲(chǔ)存液的作用是什么？
Trypsin 在 pH8 ～ 9 活力最高，所以為了防止酶的自水解， Trypsin 母液要處于一個(gè)酸性的環(huán)境里以便長(zhǎng)期保存。 Trypsin 儲(chǔ)存液的 pH 大約是 5.3 ，是用來(lái)稀釋母液用的。如果所需的酶量較大，可以直接用碳酸氫氨溶液來(lái)稀釋母液。如果酶解的樣品少，可以用儲(chǔ)存液來(lái)稀釋，這樣剩余的酶液可以在 -800C 保存到下次使用。

3. Roche 的酶和 Promega 的酶，那個(gè)更好？
Roche 的酶有自降解，而 Promega 的酶基本上沒(méi)有自降解。由于酶的自降解峰可以用來(lái)做很好的內(nèi)標(biāo)，所以一定限度的酶自降解對(duì) MALDI 數(shù)據(jù)的校準(zhǔn)很有幫助。

4. 什么情況下需要用 Ziptip 來(lái)處理樣品？
當(dāng)樣品含有大量的鹽時(shí)，需要用 Ziptip 來(lái)除鹽；當(dāng)樣品量很少，但體積比較大時(shí)（ 20 微升以上）時(shí)，需要用 Ziptip 來(lái)濃縮。如果樣品中有甘油， SDS ，或其他雜質(zhì)時(shí)， Ziptip 的使用要格外當(dāng)心，在這種情況下， Ziptip 的填料容易被雜質(zhì)堵塞；另外 Ziptip 使用不當(dāng)時(shí)，樣品會(huì)有損失。所以當(dāng)樣品比較珍貴（的來(lái)不易）時(shí)，最好先用其他樣品做預(yù)實(shí)驗(yàn)，摸順條件后，再作真正的樣品。

MALDI 篇
1. 怎樣郵寄我的樣品？
凍干的膠或干粉可以直接郵寄。切膠后的濕膠（不用做任何處理），放在 EP 管中 ( 不加任何緩沖液 ) ；用干冰速凍；郵寄時(shí)，置樣品于足夠的干冰中。液體樣品的郵寄方式同濕膠一樣。

2. 為什么要使用內(nèi)標(biāo)？
用內(nèi)標(biāo)做校準(zhǔn)可以大大減少 MALDI-MS 的誤差（ <70ppm ），從而提高查庫(kù)結(jié)果和可靠性。好的內(nèi)標(biāo)肽段需要有以下的要求：最好有兩個(gè)肽（兩點(diǎn)一線）；質(zhì)量不要在大多數(shù)的肽段范圍內(nèi)（ 1200 ～ 2500 Da ）；內(nèi)標(biāo)的量要與樣品的量成比例；內(nèi)標(biāo)對(duì)其他肽段離子化的抑止要小。我們實(shí)驗(yàn)室使用的內(nèi)標(biāo)是 25fmol 的――和――。不過(guò)，一般情況下，使用外標(biāo)做校準(zhǔn)也可以達(dá)到比較滿意的數(shù)據(jù)（ <150ppm ）。所以，顧客可以根據(jù)自己的需要來(lái)選擇是否使用內(nèi)標(biāo)。

3. 我為什么還要提供正負(fù)空白膠正對(duì)照提供 (exact) 對(duì)照兩塊膠？
正負(fù)對(duì)照的兩塊膠是用來(lái)對(duì)整個(gè)鑒定過(guò)程做質(zhì)量控制的。負(fù)對(duì)照（空白膠）主要是看樣品是否有污染（比如角蛋白的污染）；正對(duì)照（已知膠，比如同一塊膠上的標(biāo)準(zhǔn)蛋白）主要是檢測(cè)酶解和質(zhì)譜的效果是否正常。如果客戶不能提供正負(fù)對(duì)照，我們可以使用自己預(yù)先準(zhǔn)備的膠條。如果顧客的樣品量大（ >10 個(gè) 2D 膠上的點(diǎn)），則顧客必須提供正負(fù)對(duì)照。

4. 對(duì)于膠上蛋白質(zhì)的鑒定，我應(yīng)該提供多少蛋白質(zhì)？
一般情況下，考染能看得見(jiàn)的點(diǎn)都有機(jī)會(huì)鑒定出來(lái)。分子量在 2 － 5 萬(wàn)之間的蛋白質(zhì)，鑒定成功率一般比較大。分子量小的蛋白酶切位點(diǎn)少，合適的肽段（ 1000 ～ 3000 Da ）就少，所以鑒定的成功率相對(duì)較低。而分子量太大的蛋白質(zhì)，在同等質(zhì)量的情況下，蛋白的摩爾數(shù) (pmol) 較少；而且查庫(kù)時(shí)匹配肽段的覆蓋率會(huì)比較低（因?yàn)檎麄�(gè)蛋白質(zhì)較大），從而影響鑒定的成功率。

5. 為什么我的 MALDI 圖譜中都是相差 44Da 的峰，肽段的峰則全被抑制了？
相差 44Da 的峰可能是 Triton X 峰 ，也可能是 polymer （ -CH2CHOH- ）峰。這些 polymer 是從 EP 管的內(nèi)壁瀝濾（ leaching ）出來(lái)的。所以 樣品中不能含有 Triton X 。 另外實(shí)驗(yàn)中不能使用加有可塑劑（ plasticizer ）或塑料軟化劑的離心管（比如 PCR 管）來(lái)裝取樣品。最好是使用進(jìn)口 EP 管。另外，可以用 60 ％的乙腈 /0.1%TFA 去清洗 EP 管的內(nèi)壁以防瀝濾。清洗后，要等到殘留液都揮發(fā)（ air dry or speed vac ）后再裝樣品。 此過(guò)程中要注意不讓雜質(zhì)灰塵落入管內(nèi)。 另外，試驗(yàn)操作過(guò)程中所佩戴的塑膠手套也可能有可塑劑。所以一定要佩戴無(wú)塵的手套。每次用手打開(kāi)或觸摸盛有樣品的 EP 管時(shí)，一定注意不要碰到 EP 管蓋的內(nèi)壁。開(kāi)蓋時(shí)，可以使用 Eppendorf 槍上的金屬拉桿（動(dòng)作如開(kāi)啤酒瓶蓋兒）。從凍干機(jī)中取出 EP 管時(shí)，最好拿在蓋子和管子的連接部分或蓋子的突出部分。膠的染色和脫色中，盡量不要觸摸膠（即便是帶了手套）。可以用廚房用的鏟子（帶鏤空的那種，超市里有賣）來(lái)操作。

6 ．各種去垢劑對(duì) MALDI 有何影響？
離子型去垢劑對(duì) MALDI 的影響要比非離子型去垢劑大。去垢劑濃度越高，影響越大。
在濃度為 1.0% (w/v) 時(shí) : 除了一些糖類的非離子型去垢劑，大部分去垢劑會(huì)把蛋白質(zhì)的信號(hào)減低 10 倍。
At 0.01% detergent concentration (w/v): 只有 SDS 和�；悄懰嵊绊懶盘�(hào)。但它們會(huì)使信號(hào)減低超過(guò) 20 倍。
在濃度為 0.1% (w/v) 時(shí) : 不同的去垢劑對(duì)信號(hào)的影響差別比較大。具體效果見(jiàn)下 表。信號(hào)指有去垢劑時(shí)的信號(hào)和無(wú)去垢劑時(shí)的信號(hào)之比。

參考文獻(xiàn)： Vorm, Ole, Brian T. Chait and Peter Roepstorff, Mass Spectrometry of Protein Samples Containing Detergents , 41th ASMS Conference Proceedings, (1994) 621a-621b.

7 ． 為什么我的 MALDI 圖譜中都是相差 111Da 的峰？
有可能樣品在超慮時(shí)接觸了聚砜樹(shù)脂（ polysulfone ）的膜。 Polysulfone 有四個(gè)峰。各個(gè)系列的峰之間相差 111Da 。

8. 怎樣避免角蛋白的污染？
常見(jiàn)的角蛋白有四種，主要是從皮膚屑（直接接觸）和頭皮屑（空氣傳播）中來(lái)的。質(zhì)譜中 檢測(cè)到的角蛋白峰應(yīng)該是在酶解前就進(jìn)入樣品中來(lái)的（主要是在染膠，脫色，切膠和加酶這四步）。試驗(yàn)中一定要佩戴手套；一定要仔細(xì)清洗染膠的容器（先用 70 ％酒精洗，再用去離子水洗）；切膠要帶口罩，并在通風(fēng)櫥中進(jìn)行。另外，從來(lái)源于實(shí)驗(yàn)操作人員穿著的毛衣中的羊的角蛋白也被檢測(cè)到過(guò)，所以試驗(yàn)中要穿試驗(yàn)服。

9 ． MALDI 檢測(cè)時(shí)，有那些常見(jiàn)的角蛋白峰？
質(zhì)譜中常見(jiàn)的角蛋白峰有：
1319.575, 1349.679, 1474.741, 1474.777, 1656.785, 1706.742, 1715.843, 1739.697, 1790.719, 1838.984, 1889.849, 1992.969, 2090.874, 2285.116, 2382.943, 2399.203, 2500.059, 2509.123, 2650.381, 2704.152, 2830.185, 3222.272, 3223.368, 3311.299

其中最常見(jiàn)，強(qiáng)度又高的有 ( 按強(qiáng)度排列 ) ：
1. 2382.9
2. 1706.7
3. 2704.1
4. 3311.3

這些數(shù)據(jù)是從多次實(shí)驗(yàn)中總結(jié)得來(lái)的，實(shí)驗(yàn)條件不同，可能會(huì)得到不同的結(jié)果。

10. 單一同位素肽段質(zhì)量（monoisotopic peptide mass）和平均同位素肽段質(zhì)量（average peptide mass）有什么不同？
組成蛋白質(zhì)的原子在自然界中存在著不同比例的同位素（見(jiàn)下表）。所以含有這些同位素原子的肽段的質(zhì)量比不含任何同位素的肽段的質(zhì)量要大。不含任何同位素的肽段的質(zhì)量叫單一同位素肽段質(zhì)量；同一種肽段所有的同位素形式（包括含同位素的，也包括不含同位素的）的質(zhì)量的平均數(shù)叫平均同位素肽段質(zhì)量。

11. 怎樣在質(zhì)譜的圖譜上確定單一同位素峰和平均同位素峰?
在分辨率低的質(zhì)譜圖譜上，所顯示的峰一般是平均同位素峰。但目前常用的質(zhì)譜方法（比如 MALDI-TOF ）分辨率一般都很高，一般的小分子（比如肽段）常含有 4 到 5 個(gè)同位素峰，其中分子量最小的那個(gè)就是單一同位素峰。但是，當(dāng)用質(zhì)譜檢測(cè)大分子（比如完整蛋白質(zhì)）時(shí)，同位素峰的數(shù)目很多，難以在圖譜上區(qū)分。在這種情況下，使用平均同位素質(zhì)量會(huì)比較更有意義。

12. 同位素峰之間一定是相差 1 Da 嗎？
同位素肽段的質(zhì)量（ m ）一般是相差 1 Da ，但因?yàn)橘|(zhì)譜檢測(cè)到的峰是肽段的質(zhì)荷比（ m/z ），而不是質(zhì)量本身，所以在肽段帶有多個(gè)電荷的情況下，其質(zhì)荷比相差要小于 1 。如果檢測(cè)到的肽段帶一個(gè)電荷，那同位素峰之間是相差 1 ；如果檢測(cè)到的肽段帶兩個(gè)電荷，那同位素峰之間便相差 0.5 ；如果檢測(cè)到的肽段帶三個(gè)電荷，那同位素峰之間便差 0.33 ；以此類推。所以從同位素峰之間的間距，可以推斷出肽段的帶電情況（ z ），從而推斷出肽段的單一同位素質(zhì)量 [(m/z)*z] 。

13. 哪種離子化方式產(chǎn)生的肽段易帶多個(gè)電荷？
在蛋白質(zhì)組學(xué)所涉及的質(zhì)譜技術(shù)中，常見(jiàn)的離子化方式有 MALDI 和 ESI 。目前，對(duì)這兩種方法的原理和離子化的具體細(xì)節(jié)還沒(méi)有一個(gè)公認(rèn)的闡述。但經(jīng)驗(yàn)表明， MALDI 所產(chǎn)生的離子化肽段只帶一個(gè)電荷（正離子方式）。而 ESI 所產(chǎn)生的離子化肽段往往帶有多個(gè)電荷。

14. 單一同位素峰一定是最高的峰嗎？
單一同位素峰一定是一組峰里面質(zhì)荷比最低的，但不一定是最高的。當(dāng)肽段的分子量較小時(shí)，其所含的原子總數(shù)也少，所以整個(gè)肽段含有同位素原子的幾率也比較小。這時(shí)，單一同位素峰往往是最高的峰。當(dāng)肽段的分子量增大時(shí)，其帶有同位素原子的幾率也隨之增大。在這種情況下，＋ 1 Da ，甚至＋ 2 Da 的同位素峰有可能成為最高峰。統(tǒng)計(jì)表明，當(dāng)肽段的分子量超過(guò) 2500 Da 時(shí)，最高峰往往不是單一同位素峰。

15. 單一同位素峰的鑒定有什么意義？
單一同位素峰的鑒定對(duì)后續(xù)的查庫(kù)工作有重要意義。質(zhì)譜法鑒定蛋白質(zhì)一般是把得到的質(zhì)核比數(shù)據(jù)和數(shù)據(jù)庫(kù)里的數(shù)據(jù)比對(duì)。所以，如果所采集的數(shù)據(jù)里混有不是單一同位素峰的質(zhì)量，那么就有可能在查庫(kù)時(shí)找不到目標(biāo)蛋白質(zhì)，或是找到其他的蛋白質(zhì)，從而嚴(yán)重影響比對(duì)的效率和真實(shí)性。