高分辨率熔解曲線分析甲基化研究應用
高分辨率熔解曲線分析甲基化研究應用
—表觀遺傳學中檢測CpG位點的一種新技術
甲基化敏感性高分辨率熔解曲線分析（MS-Hi-Res Melting®）是一種不需要PCR產物后續(xù)操作的，簡單且靈敏的檢測基因甲基化水平的方法。該方法主要通過比較曲線的熔解溫度和峰形得以實現(xiàn)。該方法可以在一系列的CpG位點中檢測出單一的一個甲基化的發(fā)生，同時，也可以對一系列的CpG位點的甲基化水平進行分析。
單個CpG位點的甲基化和平均的甲基化水平會對熔解曲線的形狀造成影響。采用重亞硫酸鹽處理DNA模板可以使5-甲基胞嘧啶轉化為尿嘧啶。在PCR反應中，尿嘧啶可以與腺嘌呤配對，最終使得胞嘧啶轉化成胸腺嘧啶。樣品中的GC含量發(fā)生了變化，最終被轉化成了熔解曲線Tm值之間的差異。CpG位點在小的擴增片段內的相對位置也會對熔解峰的形狀產生影響，因此，Tm值和熔解峰的形狀可以被用在表觀遺傳學的研究中。
對于甲基化研究中一些常見的問題，我們采用了有三種方法來克服。1，采用商品化的試劑來減少復制過程中的堿基轉變之間的差異；2，重亞硫酸鹽處理過的DNA會迅速的降解，我們的結果證明樣品在4°C下可在TE緩沖液中保存幾個月；3，采用內部的熔解溫度校正，盡量減少樣品之間的差異。
示例：我們擴增了一個含有5個CpG位點的miRNA-195基因片段。發(fā)現(xiàn)采用高分辨率的儀器LightScanner和飽和染料LCGreen Plus適用于檢測的甲基化水平從10%到100%，并且當一段基因的甲基化水平在39%和40%之間時，儀器也能區(qū)分出細微的熔解曲線之間的差異。通過實驗有如下發(fā)現(xiàn)：1，小的復制片段的Tm值隨著甲基化水平的增加而增加；2，采用內部的校正可以改善Tm值和平均甲基化之間的相關性；3，異源二聚體含量的增加能夠擴大衍生熔解峰形狀之間的差異，并且采用商品化的試劑盒可以延長經重亞硫酸鹽處理過的DNA樣品的保存時間；4，熒光定量PCR的檢測證明模板有較好的穩(wěn)定性。
圖1:用于研究的材料中的甲基化平均水平的分布情況。miRNA-195基因的小擴增片段中含有的5個CpG位點被用來做研究。平均的甲基化水平通過測序得到的相對C:T峰的高度來估算。圖中的顏色代表不同的樣品，在下面的圖中也采用同樣的標準。
圖2:甲基化水平的不同導致的Tm值之間的差異。通過校正可以加強甲基化水平和Tm值之間的相關性。在上面的兩幅圖中，圖A是沒有校正的衍生熔解峰，圖B是觀測到的Tm值和平均的甲基化水平之間的相關性。在下面的兩幅圖中，圖C是校正過的衍生熔解峰，圖D是觀測到的Tm值和平均的甲基化水平之間的相關性。通過校正，數(shù)據(jù)之間的相關性得到了改善。平均的甲基化水平如下：粉色（100%），深綠色（40%），淺綠色（40%），橘黃色（39%），深藍色（10%），淺藍色（8%）。注意：橘黃色的樣品的相對位置在校正過以后和綠色樣品的Tm值更為接近（圖C所示），這和測序得到的結果是吻合的。
圖3:未進行校正的一些腫瘤樣品和過作為對照的過甲基化樣品的衍生熔解峰。152bp miRNA-195小擴增片段5個CpG位點的平均甲基化水平如下：粉色（100%），深綠色（40%），淺綠色（40%），深藍色（10%）。如在上圖A中所示，代表過甲基化樣品的粉色峰和低甲基化樣品的深藍色峰形狀上都更尖銳，可以由樣品中存在很少的異源雙鏈的含量來解釋。深綠色和淺綠色峰形的差異可能是由于在2，4，5的甲基化位點上的甲基化位點特異性所引起的。
參考文獻
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