甲基化芯片在表觀遺傳學(xué)中的應(yīng)用

表觀遺傳改變可以定義為基因的遺傳性或獲得性改變，但是這種改變和DNA序列改變無關(guān)。DNA甲基化是最為常見的表觀遺傳改變；啟動子或第一外顯子CpG島中的甲基化改變將導(dǎo)致基因表達失活；組蛋白的化學(xué)修飾也可以作為表觀遺傳改變；組蛋白發(fā)生乙�；�改變的基因通常被開啟。

    CpG島的異常甲基化是導(dǎo)致基因沉默和過度表達的最主要的改變，常規(guī)的方法不能在全基因組水平上對甲基化進行檢查。表觀遺傳分析與基因芯片技術(shù)結(jié)合起來則可以高通量進行甲基化的定性、定量分析。

    目前建立了2種基于芯片的甲基化分析方法：一個是甲基化特異寡核苷酸芯片(methylation specific oligonucleotide arrays，MSO)方法，另一個是差異甲基化雜交法(differential methylation hybridization method，DMH)。第一種方法利用直接雜交原理，只是在標記前先用亞硫酸氫鈉處理DNA，從而使所有未甲基化的胞嘧啶轉(zhuǎn)變?yōu)槟蜞奏�，而甲基化的胞嘧啶并不受該處理的影響，仍舊為胞嘧啶。這種方法一般針對已知個別基因的調(diào)控區(qū)進行研究，不能對大量基因尤其是未知基因的甲基化分析。

    DMH法是一種嶄新的方法，為大規(guī)模研究CpG島甲基化譜提供了高通量的技術(shù)平臺。DMH法和表達譜基因芯片類似，只是靶基因和探針制備方法比cDNA表達譜芯片更復(fù)雜。DMH方法最初是基于CpG島(CGl)文庫建立的。Cross等構(gòu)建了含有甲基化CpG結(jié)合域的親和基質(zhì)(affinity matrix)，從人類基因組DNA中分離出CpG島序列。限制性內(nèi)切酶MseI能將DNA消化為小片段，但是對絕大部分CpG島序列沒有作用。用親和柱將富含GC的MseI處理片段分離出來，克隆人載體中構(gòu)建文庫。預(yù)先篩選CpG島克隆使之具有多個BstUI酶切位點，擴增后的片段用于芯片的制備。從實驗樣本中提取基因組DNA，用MseI處理。酶切后的探針能夠和CGI文庫中的Mse工處理靶基因結(jié)合。酶切后的富含GC的片段接上接頭(1inker)，然后用甲基化敏感性內(nèi)切酶BstUI處理，BstUI處理的和未處理的對照DNA進行l(wèi)inker—PCR和熒光標記。以后的雜交、圖像和數(shù)據(jù)處理過程與表達譜芯片完全一樣。

    最初，DMH應(yīng)用于尼龍膜對人類乳腺癌細胞系中的CpG島進行分析，后來被應(yīng)用于玻璃芯片以提高檢測通量。在對乳腺癌的表觀遺傳學(xué)改變分析中發(fā)現(xiàn)，CpG島的過甲基化可以導(dǎo)致抑癌基因的沉默，以及在一些細胞表現(xiàn)下調(diào)。通常，低分化的腫瘤組織比中度分化或分化良好的正常組織表現(xiàn)更高的甲基化程度。

   DMH已經(jīng)成功應(yīng)用于檢測卵巢癌的甲基化譜。較之卵巢癌細胞系，在卵巢癌組織樣本中可見更多的甲基化CpG島。Ottaviano等通過評估位于人ERa基因第1個外顯子的CpG島甲基化狀態(tài)，鑒定了MS()策略的可行性。MSO芯片實驗結(jié)果和傳統(tǒng)的DNA印跡和亞硫酸鹽序列分析甲基化的方法結(jié)果一致。Rober等用這個技術(shù)研究腫瘤抑制基因p16的啟動子區(qū)域，這個基因在許多腫瘤中高甲基化。這個啟動子的高甲基化抑制了p16的轉(zhuǎn)錄，與一些腫瘤相關(guān)；他們發(fā)現(xiàn)p16的啟動子區(qū)域在H1299細胞株的CpG位點均一的甲基化。

    不同的甲基化譜反映了腫瘤的不同階段或不同類型。CpG島的高甲基化位點與腫瘤發(fā)生相關(guān)，因此可以作為特定腫瘤亞型獨特的后天標記。因此，就像基因表達譜，基于甲基化譜的聚類分析也可以用于分析腫瘤的亞型。這些基礎(chǔ)研究具有潛在的應(yīng)用價值，應(yīng)用研究的方向包括對腫瘤相關(guān)的DNA甲基化模式為基礎(chǔ)的輔助診斷方法的研發(fā)和通過抑制腫瘤細胞的DNA甲基化的或組蛋白去乙酰基化的方法及藥物來治療腫瘤。