PCR的引物設(shè)計注意要點

計算：
對于低于20個堿基的引物，Tm值可根據(jù)Tm=4(G C) 2(A T)來粗略估算；
對于較長引物，Tm值則需要考慮熱動力學(xué)參數(shù)，從“最近鄰位”的計算方式得到，這也是現(xiàn)有的引物設(shè)計軟件最常用的計算方式。
Tm = △H/(△ S R * ln (C/4)) 16.6 log ([K ]/(1 0.7 [K ])) - 273.15　　

引物二級結(jié)構(gòu)：
引物二聚體，盡可能避免兩個引物分子之間3’端有有較多堿基互補

發(fā)夾結(jié)構(gòu)：
尤其是要避免引物3’端形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，否則將嚴(yán)重影響DNA聚合酶的延伸。

引物3’端：
引物的延伸從3’端開始，因此3’端的幾個堿基與模板DNA均需嚴(yán)格配對，不能進(jìn)行任何修飾，否則不能進(jìn)行有效的延伸，甚至導(dǎo)致PCR擴增完全失敗。考慮到密碼子的簡并性，引物3’端最后一個堿基最好不與密碼子第三個堿基配對。

引物5’端：
引物5’端可以有與模板DNA不配對堿基，在5’端引入一段非模板依賴性序列。
5’端加上限制性核酸內(nèi)切酶位點序列（酶切位點5’端加上適當(dāng)數(shù)量的保護(hù)堿基）。
5’端的某一位點修改某個堿基，人為地在產(chǎn)物中引入該位點的點突變以作研究。
5’端標(biāo)記放射性元素或非放射性物質(zhì)（如生物素、地高辛等）。

引物的內(nèi)部穩(wěn)定性：
過去認(rèn)為，引物3’端應(yīng)牢牢結(jié)合在模板上才能有效地進(jìn)行延伸，故3’端最好為G或C。
現(xiàn)在的觀點認(rèn)為，引物的5’端應(yīng)是相對穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，而3’端在堿基配對的情況下最好為低穩(wěn)定性結(jié)構(gòu)，即3’端盡可能選用A或T，少用G或C。
僅僅3’端幾個堿基與非特異位點上的堿基形成的低穩(wěn)定性結(jié)構(gòu)是難以有效引發(fā)引物延伸的。
如果3’端為富含G、C的結(jié)構(gòu)，只需3’端幾個堿基與模板互補結(jié)合，就可能引發(fā)延伸，造成假引發(fā)。

引物的保守性與特異性
保守性：通用引物——檢測同一類病原微生物盡可能多的型別；
特異性：避免非特異性擴增。