小鼠胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)實驗步驟

     一般培養(yǎng)-保持處于未分化狀態(tài)
培養(yǎng)基
細(xì)胞復(fù)蘇
凍存細(xì)胞
明膠包被
細(xì)胞傳代

     體外分化
培養(yǎng)基
包被有多聚鳥氨酸/纖維結(jié)合蛋白的培養(yǎng)板（使用或不使用蓋玻片）
體外分化方法

注：以下培養(yǎng)針對于小鼠的R1系，其它的培養(yǎng)可以參考。不過人的胚胎干不可以采用下面的protocol，需要用專用的protocol和培養(yǎng)基。

一般培養(yǎng)--維持ES細(xì)胞處于未分化狀態(tài)
ES用含有LIF（抑制因子）和Feed細(xì)胞的培養(yǎng)基（高糖）來阻止細(xì)胞的分化。為細(xì)胞提供包被有0.1％明膠的平板作為粘附細(xì)胞的基質(zhì)。建議每2－3天從達到80％－90％融合的平板按1：8的比率傳代細(xì)胞一次，細(xì)胞傳代以后，在將細(xì)胞接種在0.1％明膠包被的培養(yǎng)皿之前，通過預(yù)先將細(xì)胞接種在沒有經(jīng)過包被的組織培養(yǎng)板2個小時，使分化細(xì)胞粘附，從而將分化和未分化細(xì)胞分開。將細(xì)胞全程置于37℃，5％CO2，100％濕度條件下培養(yǎng)。如果在Feed細(xì)胞，那么就需要采用MMC進行處理，抑制Feed細(xì)胞增殖，但仍然能保持其分泌LIF因子的活性。下文中暫不提及Feed細(xì)胞。Feed細(xì)胞可以來源于STO細(xì)胞或原代胚胎成纖維細(xì)胞。

培養(yǎng)基
ES:
配制一20×不含DMEM，HS，LIF的溶液（該溶液也能用于EB培養(yǎng)基--見下文）。分裝在50ml 離心管中，（稀釋為2×，每管42ml），貯存在-20℃。通過將21ml該溶液，HS和LIF加入450ml DMEM中制備培養(yǎng)基，0.22 μm濾膜過濾。貯存于4℃，時間不要超過2周。

貯存液          
DMEM(高糖)          
馬血清（HS）          
L-谷氨酰胺（200mM）          
MEM NEAA（10mM）          
HEPES（1M）          
β-巰基乙醇（55Mm）          
PEST          
LIF         

復(fù)蘇細(xì)胞
細(xì)胞被凍存在10％二甲基亞砜（DMSO）中防止結(jié)晶的形成，結(jié)晶的形成會損害細(xì)胞。然而，二甲基亞砜對細(xì)胞有毒性，快速的進行細(xì)胞復(fù)蘇是很重要的。

步驟：
1．從液氮中取出一管細(xì)胞；
2．將凍存管置于37℃水浴中2分鐘（或放到管內(nèi)溶液恰好完全溶解）；
3．將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到一15ml Falcon管中；
4．加入5ml ES培養(yǎng)基（用培養(yǎng)基沖洗凍存管）；
5．離心3分鐘；
6．棄上清，用2ml ES培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，至少吹打10次；
7．接種在明膠包被（見下文）的6孔或6cm組織培養(yǎng)皿；
8．孵育。

凍存細(xì)胞
凍存液
90％HS和10％DMSO

步驟：
1．1×PBS洗細(xì)胞并留少許PBS在培養(yǎng)皿內(nèi)；
2．用細(xì)胞刮刀收集細(xì)胞；
3．將細(xì)胞轉(zhuǎn)入15ml 離心管管內(nèi)并離心3分鐘；
4．棄去上清并將細(xì)胞重懸于冷的凍存液中（10 cm的培養(yǎng)皿用2ml，15cm的培養(yǎng)皿用6－7ml。）
5．分裝于凍存管內(nèi)，每管1ml；
6．置－80℃過夜，第二天移入液氮。

Geltin（明膠）包被
準(zhǔn)備500ml 0.1％geltin溶液
1．將0.5 g明膠溶解在500ml無鈣鎂的PBS中（50－65℃水浴15～30分鐘）。
2．最好在溶液沒有冷卻的情況下通過0.22 μm濾膜過濾，貯存在4℃。
包被培養(yǎng)板或培養(yǎng)皿
1．加入足量的明膠溶液覆蓋培養(yǎng)平面（15 cm培養(yǎng)皿加2ml，10 cm培養(yǎng)皿加0.5～1 ml，溶液的量并不重要，只要能完全覆蓋培養(yǎng)表面就行了。）；
2．置室溫30分鐘；
3．去除明膠溶液，將培養(yǎng)板貯存在包裝袋中室溫放置，最好將板子平放或倒扣，以免明膠污染蓋子和流出培養(yǎng)板。

細(xì)胞傳代
建議每2天傳代細(xì)胞一次，過度生長的細(xì)胞會降低細(xì)胞的自然分化率，我們建立了一種純化方法來去除分化細(xì)胞，在將細(xì)胞接種在明膠包被的培養(yǎng)板上之前，通過將分化細(xì)胞黏附在沒有包被的組織培養(yǎng)板上去除分化細(xì)胞。純化步驟包含在下面的方法中。

1．去除培養(yǎng)液；
2．無鈣鎂PBS（Gibco）洗滌；
3．加入胰酶EDTA（Gibco）。37℃孵育5分鐘。
4．加入ES培養(yǎng)基使胰酶失活；
5．將細(xì)胞轉(zhuǎn)入15 ml離心管中離心3min；
6．去除上清，將細(xì)胞重懸于2 ml ES培養(yǎng)基，至少吹打10－20次。
如果加入培養(yǎng)基的量較少會比較容易將細(xì)胞團弄散分開。ES細(xì)胞有聚集成團的傾向，傳代過程中仔細(xì)將細(xì)胞弄散分開很重要。這樣可能會減少細(xì)胞的自然分化。
7．將細(xì)胞接種在沒有包被的組織培養(yǎng)皿中（使用和一開始同樣規(guī)格的培養(yǎng)皿）放入溫箱2小時（分化細(xì)胞在該時間內(nèi)將黏附，而ES細(xì)胞仍將保持懸�。�；
8．將含有細(xì)胞的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)入geltin包被的組織培養(yǎng)皿。吹打以確保細(xì)胞被分散開（前面已經(jīng)提到--ES細(xì)胞有聚集成團的傾向）
9．建議按1：4－1：10的比率傳代 (ATCC)
保持細(xì)胞的傳代比率很重要，以我們的經(jīng)驗，1：8的比率是好的，可以使細(xì)胞的自然分化降到最低。當(dāng)你使用不同規(guī)格的培養(yǎng)板進行細(xì)胞傳代可以使用表1來計算傳代比率。

體外分化
胚胎干細(xì)胞在體內(nèi)外可以分化為各種類型的細(xì)胞。我們的體外分化方法有利于神經(jīng)前體細(xì)胞通過在最少量的培養(yǎng)基內(nèi)選擇（第3步），在有bFGF存在的情況下擴增（第4步）并最終分化在第5步。細(xì)胞全程培養(yǎng)在37℃，5％CO2，100％濕度條件下。一般體外誘導(dǎo)向神經(jīng)細(xì)胞方向分化，也可以采用低濃度的RA進行誘導(dǎo)。
時間線（總時間為27～34天）
第2步；4＋1天 第3步；4－10天 第4步；4天 第5步；10－15天

體外向心肌細(xì)胞方向分化
胚胎干細(xì)胞在體外去除LIF情況下會自然向心肌細(xì)胞方向分化，小鼠的R1系一般在第7-8天自然出現(xiàn)搏動的心肌細(xì)胞，與胚胎發(fā)育時間線是完全一致的。

培養(yǎng)基
EB
配制一20×不含DMEM，F(xiàn)BS，LIF的溶液（該溶液也能用于ES培養(yǎng)基--見前述）。分裝在50ml 離心管中，（稀釋為2×，每管42ml），貯存在-20℃。將21ml該溶液和50ml FBS加入450mlDMEM中制備培養(yǎng)基，0.2μm濾膜過濾。貯存于4℃。
貯存液          
DMEM(高糖)          
胎牛血清          
L-谷氨酰胺（200mM）          
MEM NEAA（10mM）          
HEPES（1M）          
β-巰基乙醇（55Mm）          
PEST（P104U/mlS104μg/ml          

ITSFn and N3（分化培養(yǎng)基）：
配制一20×不含DMEM/F12的溶液。分裝在15ml 離心管中，（稀釋為1×，ITSFn 7.05ml，N3 12.55ml），0.2μm濾膜過濾，貯存在-20℃。將該溶液加入DMEM/F12中制備培養(yǎng)基，貯存于4℃。
貯存液          
DMEM(高糖)          
轉(zhuǎn)鐵蛋白50mg/ml          
胰島素5mg/ml          
亞硒酸鈉300μM          
黃體酮（20μM）          
腐胺（100μM）          
PEST（P104U/ml S104μg/ml）          
層粘連蛋白100μg/ml          
纖維連接蛋白250μg/ml           
堿性rhFGF, 10μg/ml          
*在第4步將bFGF加入N3培養(yǎng)基使終濃度為10ng/ml。

ITSFn and N3培養(yǎng)基貯存液的準(zhǔn)備
使用無菌的溶劑和稀釋液，在分裝之前要對溶液進行過濾，如果因為某些原因溶液在分裝之前沒有進行過濾，需要在管子上標(biāo)明以便別人在使用時知道該溶液不能直接用于。
貯存液  溶劑，貯存液，稀釋劑和儲存
轉(zhuǎn)鐵蛋白50mg/ml  
胰島素5mg/ml  
亞硒酸鈉300μM  
黃體酮（20μM）  
腐胺（100μM）  
PEST（P104U/ml S104μg/ml）  
層粘連蛋白（100μg/ml）  
纖維連接蛋白（250μg/ml ）  
堿性rhFGF, （10μg/ml）  

包被有多聚鳥氨酸/纖維結(jié)合蛋白的培養(yǎng)板（使用或不使用蓋玻片）

包被液的準(zhǔn)備
多聚-L-賴氨酸，15μg/ml
把75ml多聚-L-賴氨酸和425ml 1×PBS混合。貯存在4℃。
纖維結(jié)合蛋白，1μg/ml
把0.5ml纖維結(jié)合蛋白和500ml 1×PBS混合。

包被過程：
1．加入多聚-L-賴氨酸，至少2－3小時（過夜也行）
2．吸出多聚-L-賴氨酸
3．加入纖維結(jié)合蛋白，大約1－2小時
4．吸出纖維結(jié)合蛋白，放置30分鐘晾干
5．貯存在4℃
24孔板用200μl，6孔板用500μl。震蕩培養(yǎng)板確保溶液能夠覆蓋蓋玻片或培養(yǎng)孔。有時需要劇烈震蕩培養(yǎng)板。

體外分化方法

第1步：ES培養(yǎng)基
在LIF存在的條件下維持細(xì)胞培養(yǎng)

第2步：EB培養(yǎng)基
使用細(xì)菌培養(yǎng)皿去除LIF后胚狀體的形成需要4天。
1．分散純化細(xì)胞（參見上面的細(xì)胞傳代部分）
2．純化2小時后將細(xì)胞轉(zhuǎn)入含有ES培養(yǎng)基的50ml Falcon管中，計數(shù)細(xì)胞取適量體積放入15ml管中離心3分鐘。
3．用2mlEB培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，吹打至少10次制成單細(xì)胞懸液
4．一個15cm的細(xì)菌培養(yǎng)皿接種4～5×106個細(xì)胞（1個完全融合的組織培養(yǎng)皿通常足以接種4個同樣規(guī)格的細(xì)菌培養(yǎng)皿）。
5．2天后更換培養(yǎng)基
將胚狀體轉(zhuǎn)入錐形管中放置3～5分鐘使細(xì)胞沉降。棄去上清，將細(xì)胞重懸于新鮮培養(yǎng)基并接種在新的細(xì)菌培養(yǎng)皿中。
6．用EB培養(yǎng)基培養(yǎng)的第4天將細(xì)胞轉(zhuǎn)入沒有包被的組織培養(yǎng)皿中（這即是細(xì)胞的移植步驟）。1個組織培養(yǎng)皿之中放置1個細(xì)菌培養(yǎng)皿，在進行第3步之前一天將胚狀體黏附在同樣規(guī)格的培養(yǎng)板上。
形成胚狀體需要4天時間。在EB培養(yǎng)基中再培養(yǎng)1天使胚狀體粘附在組織培養(yǎng)皿的表面。這一天被認(rèn)為是第2步和第3步的分界。

第3步--ITSFn培養(yǎng)基
在最少量培養(yǎng)基中選擇神經(jīng)前體細(xì)胞
1．在胚狀體接種在組織培養(yǎng)皿一天后將培養(yǎng)基換成ITSFn培養(yǎng)基
2．并非所有胚狀體在這一時期都已經(jīng)發(fā)生粘附，因此在移除培養(yǎng)基時要小心謹(jǐn)慎以使大部分胚狀體留在培養(yǎng)皿內(nèi)。
3．保持細(xì)胞在ITSFn中培養(yǎng)大約10天，根據(jù)需要更換培養(yǎng)基--大約每隔一天。
觀察細(xì)胞形態(tài)，神經(jīng)樣細(xì)胞大約出現(xiàn)在第4到第7天。當(dāng)神經(jīng)樣細(xì)胞能夠被鑒別時，轉(zhuǎn)入到第4步。步驟的轉(zhuǎn)換應(yīng)該在神經(jīng)前體細(xì)胞出現(xiàn)第一個清晰的標(biāo)志幾天以后，通常是在第3步的第6到第10天。

第4步－N3培養(yǎng)基＋bFGF
通過將神經(jīng)前體細(xì)胞培養(yǎng)在含有10ng/ml bFGF的培養(yǎng)基中進行擴增。
1.PBS洗滌，加入1-2ml 胰酶
2．37℃孵育5分鐘
3．用4mlEB培養(yǎng)基終止胰酶活性，將細(xì)胞轉(zhuǎn)入錐形管中放置3～5分鐘移出細(xì)胞團，將上清移入一新的離心管離心。
4．將細(xì)胞重懸于含有bFGF的N3培養(yǎng)基。
5．將細(xì)胞接種在包被多聚-L-鳥氨酸/纖維連接蛋白的蓋玻片上（最好將蓋玻片放于24孔培養(yǎng)板或6孔培養(yǎng)板，6孔培養(yǎng)板中每孔放置5個蓋玻片如果是塑料的放置4個，以使最大可能的獲得樣品數(shù)量）。24孔板接種3.5×105/孔或6孔板1.7×106/孔。
6．2天后更換培養(yǎng)基

第5步－N3培養(yǎng)基
通過撤除bFGF使神經(jīng)前體細(xì)胞分化
1．細(xì)胞被接種在蓋玻片上4天后將培養(yǎng)基換成不含bFGF的N3培養(yǎng)基
2．根據(jù)需要換液（大約每隔一天）
3．分化10～15天后固定細(xì)胞
移除培養(yǎng)基
PBS洗滌
加入4%福爾馬林
室溫放置30分鐘
PBS洗滌2次
儲存于PBS。長期儲存使用含0.01％疊氮化納的PBS
移植細(xì)胞的準(zhǔn)備
細(xì)胞在胚狀體形成4天以后被移植（相應(yīng)于體外分化過程中的第2步末細(xì)胞被轉(zhuǎn)種到組織培養(yǎng)板）。正如在前文體外分化中所描述的在移植之前4天開始形成胚狀體。通常再需要一天時間以便將胚狀體移植入一10cm的培養(yǎng)皿。

移植
1．將胚狀體轉(zhuǎn)移至一15ml 圓錐形管中放置3～5分鐘使胚狀體沉降下來。
細(xì)胞被離心3分鐘會更好。放置使之沉降將會去除更多的單個細(xì)胞（包括死細(xì)胞）而這些細(xì)胞可以被離心下來。
2．去除上清將胚狀體重懸于無鈣鎂離子的1×PBS中
3．離心3分鐘
4．去除上清加入1×胰酶（10cm的培養(yǎng)皿加1ml）
5．37℃水浴5分鐘
6．加入5mlEB培養(yǎng)基小心吹打約10次
小心處理細(xì)胞很重要，進行細(xì)胞傳代分散細(xì)胞時不可劇烈吹打。
7．離心2分鐘
8．吸出上清將細(xì)胞重懸于500μl EB培養(yǎng)基
9．用光滑的巴斯德吸管小心吹打5次
10．離心2次
11．吸出上清將細(xì)胞重懸于100μl EB培養(yǎng)基

煙酸己可堿標(biāo)記ES細(xì)胞進行移植
1．準(zhǔn)備一10μg/ml的煙酸已可堿染液（雙苯酰亞胺，在冷凍室118）
2．加入1mg（你能稱到的最小量）到5ml EB培養(yǎng)基（制成200μg/ml）
3．將溶液稀釋成10μg/ml （100μl 200μg/ml 溶液和1.9ml EB培養(yǎng)基）
4．如前所述將細(xì)胞重懸于2ml煙酸已可堿染液而不是EB培養(yǎng)基中制備ES細(xì)胞懸液，
5．將懸液置于室溫（或冰上）30分鐘
6．離心2分鐘
7．吸出上清將細(xì)胞重懸于2ml EB培養(yǎng)基
8．重復(fù)一次
9．離心2分鐘
10．吸出上清將細(xì)胞重懸于100μl EB培養(yǎng)基并置于冰上。