生物發(fā)光特征與應(yīng)用

生物發(fā)光特征與應(yīng)用

生物發(fā)光（bioluminescence、BL）是指生物體發(fā)出的光輻射，是生物體釋放能量的一種形式，這種發(fā)光現(xiàn)象廣泛地分散在生物界中。它不依賴于有機(jī)體對(duì)光的吸收，而是一種特殊類型的化學(xué)發(fā)光，也是氧化發(fā)光的一種。生物發(fā)光的一般機(jī)制是：由細(xì)胞合成的化學(xué)物質(zhì)，在一種特殊酶的作用下，使化學(xué)能轉(zhuǎn)化為光能。自然界具有發(fā)光能力的有機(jī)體種類繁多。一些細(xì)菌和高等真菌有發(fā)光現(xiàn)象。動(dòng)物界25個(gè)門中，就有13個(gè)門28個(gè)綱的動(dòng)物具有發(fā)光現(xiàn)象，從最簡(jiǎn)單的原生動(dòng)物到低等脊椎動(dòng)物中都有發(fā)光動(dòng)物，如鞭毛蟲、海綿、水螅、海生蠕蟲、海蜘蛛和魚等。動(dòng)物的發(fā)光，除其自身發(fā)光即一次的發(fā)光以外，由寄生或共生而產(chǎn)生二次發(fā)光的例子也不少。不同生物體的發(fā)光顏色不盡一致，多數(shù)發(fā)射藍(lán)光或綠光，少數(shù)發(fā)射黃光或紅光。

目前，根據(jù)發(fā)光的機(jī)理不同國(guó)際上將生物發(fā)光分為四種
1．受激熒光是指生物體在受到外界光輻射的作用時(shí)，體內(nèi)固有的熒光物質(zhì)或吸收的熒光標(biāo)記物發(fā)光的現(xiàn)象。 2．發(fā)光生物發(fā)光。以螢火蟲的閃光為代表。 
3．化學(xué)發(fā)光 
化學(xué)發(fā)光是在化學(xué)反應(yīng)過程中(主要為氧化還原反應(yīng))發(fā)出可見光的現(xiàn)象�；瘜W(xué)發(fā)光反應(yīng)是由兩個(gè)關(guān)鍵步驟組成：激發(fā)和發(fā)射。許多化學(xué)反應(yīng)進(jìn)行時(shí)能釋放足夠的自由能而把參加反應(yīng)的物質(zhì)之一激發(fā)到能發(fā)射光的電子激發(fā)態(tài)，生成一種激發(fā)態(tài)產(chǎn)物，在它回到基態(tài)時(shí)，剩余能量轉(zhuǎn)變成光子能量產(chǎn)生發(fā)光現(xiàn)象。 
4．生物超微弱發(fā)光 
隨著生物發(fā)光研究的進(jìn)一步深入，發(fā)現(xiàn)人體的器官、組織、細(xì)胞、乃至大分子都在發(fā)光，不過發(fā)光強(qiáng)度更弱。目前研究已涉及到細(xì)胞、亞細(xì)胞乃至生物大分子的層次。越來越多的實(shí)驗(yàn)表明，DNA 是生物超微弱發(fā)光的一個(gè)輻射源。

生物發(fā)光還可分為:
1．被動(dòng)發(fā)光：如植物，那些微弱的紅光是沒能參與光合作用多余的光，一般的看法是這種光無意義。
2. 主動(dòng)發(fā)光：如螢火蟲的閃光。
另外，有些動(dòng)物本身并不會(huì)發(fā)光，但在共生的環(huán)境中它們會(huì)利用發(fā)光細(xì)菌的光為自己服務(wù)。
動(dòng)物的發(fā)光器有兩類，一類具有發(fā)光細(xì)胞，另一類具有共生的發(fā)光細(xì)菌
發(fā)光細(xì)胞是起源于皮膚而發(fā)生了變異和特化的腺細(xì)胞，能分泌熒光素和熒光素酶。           如果發(fā)光細(xì)胞內(nèi)同時(shí)含有熒光素和熒光素酶，則發(fā)光可在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行，此稱細(xì)胞內(nèi)發(fā)光；如果發(fā)光細(xì)胞內(nèi)僅含有熒光素或熒光素酶，則發(fā)光必須在分別含有熒光素和熒光素酶的不同發(fā)光細(xì)胞之分泌物相遇時(shí)才能產(chǎn)生，此稱細(xì)胞外發(fā)光。

生物發(fā)光的機(jī)制：
熒光素酶（Lu ciferase）以熒光素（Luciferin）、三磷酸腺苷（ATP）和O2為底物，在Mg2＋存在時(shí)，底物在催化循環(huán)中會(huì)形成還原型核黃素磷酸鹽和醛化合物，當(dāng)遇到熒光素酶和氧時(shí)，形成一種激發(fā)的絡(luò)合物。絡(luò)合物斷裂時(shí)生成氧化核黃素磷酸鹽、酸、水及一個(gè)光子，化學(xué)能轉(zhuǎn)變?yōu)楣饽堋?
熒光素+ ATP+ O2→核黃素磷酸鹽+醛化合物

核黃素磷酸鹽+醛化合物→激發(fā)的絡(luò)合物

激發(fā)的絡(luò)合物→氧化核黃素磷酸鹽+酸+水+光子

化學(xué)能→光能

ATP既是熒光素酶催化發(fā)光的必需底物，又是所有生物生命活動(dòng)的能量來源。在熒光素酶催化的發(fā)光反應(yīng)中，ATP在一定的濃度范圍內(nèi)，其濃度與發(fā)光強(qiáng)度呈線性關(guān)系。

生物發(fā)光的特點(diǎn)： 
1 生物發(fā)光的顏色范圍很寬，可從紅光到深藍(lán)光；
2 氧是幾乎所有生物發(fā)光系統(tǒng)中必須的因素；
3 生物發(fā)光是由“熒光素酶”與“熒光素”的化學(xué)反應(yīng)所引起的；
4 所有的生物發(fā)光反應(yīng)幾乎都是酶-底物類型的反應(yīng)，但復(fù)雜程度不同，某些生物發(fā)光反應(yīng)涉及3種或4種底物，而另一些生物發(fā)光反應(yīng)甚至需要3個(gè)或4個(gè)酶的體系。
5 高效率。在發(fā)光的同時(shí)，沒有輻射熱能的消耗，因而生物發(fā)光的效率是很高的。幾乎能將化學(xué)能百分之百地轉(zhuǎn)變?yōu)榭梢姽�，為普通電光源效率的幾倍到幾十倍�?
6 安全性。因?yàn)槔涔獗旧頍o熱，所以沒有爆發(fā)火花的危險(xiǎn)，在油庫(kù)、炸藥庫(kù)、礦井等易燃易爆場(chǎng)所，用其作照明光源最為理想，因此被稱為“安全之光”。

生物發(fā)光的應(yīng)用
1. ATP生物熒光檢測(cè)
ATP生物熒光檢測(cè)是基于熒火蟲發(fā)光機(jī)理所設(shè)計(jì)，熒火蟲發(fā)光細(xì)胞內(nèi)具有特殊的發(fā)光物質(zhì)-熒光素及熒光素酶，熒光素易被氧化，它在熒光素酶催化下，由ATP激活，使之與氧結(jié)合，熒光素分子中的電子躍遷到高能級(jí)，處于不穩(wěn)定的激發(fā)態(tài)，當(dāng)電子跳回到低能級(jí)時(shí)，即發(fā)出熒光光子。由于ATP能不斷提供能量，因而熒光素分子不斷地被激活，即可連續(xù)地發(fā)出熒光，其熒光強(qiáng)度與ATP濃度在一定范圍內(nèi)成線性關(guān)系，通過用發(fā)光光度計(jì)，可以檢測(cè)出待測(cè)液中ATP含量。該法靈敏度極高，可檢測(cè)出10μl樣品中的ATP含量。研究表明，各生長(zhǎng)期的細(xì)菌均有較恒定水平的ATP含量，因此，提取細(xì)菌的ATP，利用生物發(fā)光法測(cè)出ATP含量后，即可推算出樣品中的含菌量，整個(gè)過程僅為十幾分鐘。由于生物發(fā)光法無需培養(yǎng)微生物過程，操作簡(jiǎn)便、靈敏度高，在短時(shí)間內(nèi)即可得到檢測(cè)結(jié)果，具有其他微生物檢測(cè)方法無可比擬的優(yōu)勢(shì)，是目前檢測(cè)微生物最快的方法之一 .

2. 利用生物發(fā)光蛋白測(cè)定細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+ 

Ca2+對(duì)細(xì)胞的代謝與功能的調(diào)節(jié)作用幾乎涉及到細(xì)胞的所有生理和生化過程。細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+濃度及其分布的變化代表著某種細(xì)胞功能的啟動(dòng)、加強(qiáng)和抑制，是形成Ca2+信號(hào)的基礎(chǔ)。研究Ca2+與細(xì)胞功能的關(guān)系具有十分重要的意義。利用光蛋白與Ca2+反應(yīng)極其靈敏的特性，可以測(cè)出微量Ca2+的含量。
1967年，Ridgway和Ashley用從水母(acguoreaforskalea)中分離出的一種蛋白質(zhì)—水母發(fā)光蛋白(acguorin)，第一次成功地測(cè)定了活細(xì)胞內(nèi)[Ca2+]。水母蛋白與Ca2+結(jié)合后激活而發(fā)出藍(lán)色熒光(465mm)，在0.1～10μmol/L Ca2+范圍內(nèi)熒光強(qiáng)度與[Ca2+]成正相關(guān)，是目前應(yīng)用最廣的一種Ca2+生物發(fā)光指示劑。 Ca2+生物發(fā)光指示劑不受光漂白效應(yīng)的影響，對(duì)細(xì)胞無毒性.  

3應(yīng)用在免疫檢測(cè)中進(jìn)行標(biāo)記物的超靈敏檢測(cè)。
BL反應(yīng)已經(jīng)被證明是檢測(cè)酶標(biāo)記的極為靈敏的方法，依賴于螢火蟲熒光素酶熱穩(wěn)定突變體標(biāo)記的醋酸激酶BL檢測(cè)可以得到極低的檢測(cè)極限(8.5x10-23 mol)

4．微孔板上的生物發(fā)光
基于超靈敏的光電耦荷裝置（CCD）的成像系統(tǒng)，可以同時(shí)測(cè)量整個(gè)384孔板的BL信號(hào)。其中每個(gè)孔的信號(hào)都會(huì)通過對(duì)BL數(shù)字圖象進(jìn)行軟件分析得到精確的定量。通過對(duì)直觀可視信號(hào)的評(píng)估，測(cè)量得到的BL光信號(hào)會(huì)被轉(zhuǎn)變成假色，而更加突出不同的光強(qiáng)度，如

5. 酶抑制劑篩選
一種BL檢測(cè)方法可以用來檢測(cè)蛋白酶活性。水母融合蛋白(配合一個(gè)最優(yōu)的自然蛋白酶酶切位點(diǎn))被固化在微孔板空內(nèi)，作為HIV-1蛋白酶的底物。蛋白酶水解鍵后從固態(tài)上釋放出水母蛋白，從而增加了BL信號(hào)。這個(gè)系統(tǒng)可以通過在BL融合蛋白中引入特定的酶切位點(diǎn)而針對(duì)不同蛋白酶進(jìn)行抑制劑篩選。

6．活體動(dòng)物成像
BL反應(yīng)所產(chǎn)生的可見光可以部分的透過動(dòng)物組織，因此可以在整體動(dòng)物的模式下進(jìn)行成像。BL全體細(xì)胞和分子成像作為一種靈敏、可定量、非侵入性的和實(shí)時(shí)的方法，可以用來對(duì)活體動(dòng)物進(jìn)行生物學(xué)研究，并將對(duì)生物技術(shù)、分子醫(yī)學(xué)、基因治療和藥物研發(fā)等領(lǐng)域產(chǎn)生深遠(yuǎn)的影響。

7．體內(nèi)基因表達(dá) 
體內(nèi)基因表達(dá)模式方面的研究。在藥物研發(fā)領(lǐng)域，科學(xué)家通過可發(fā)光轉(zhuǎn)基因動(dòng)物（例如：大鼠或小鼠基因組中整合了修飾的內(nèi)源基因和BL報(bào)告基因）作為人類疾病的模式動(dòng)物進(jìn)行目標(biāo)確認(rèn)的研究。 例如：目前已經(jīng)建立了一個(gè)轉(zhuǎn)基因小鼠模型，可以監(jiān)測(cè)編碼人細(xì)胞色素P450 3A4（CYP3A4）基因的體內(nèi)轉(zhuǎn)錄調(diào)控，人細(xì)胞色素P450 3A4在藥物代謝方面起著重要作用。

8．傳染性疾病 
疾病的進(jìn)程和治療劑的功效可以通過對(duì)小鼠注射BL標(biāo)記進(jìn)行評(píng)估。例如注射經(jīng)過修飾的病原微生物，然后對(duì)透過動(dòng)物組織的光進(jìn)行成像。使用這種方法，可以檢測(cè)活小鼠胃腸道內(nèi)重組的發(fā)光沙門氏菌的定殖和不同的喂食物質(zhì)對(duì)其的影響。

9. 腫瘤研究 
與藥物功效研究相同，腫瘤的生長(zhǎng)與轉(zhuǎn)移，可以通過活體中注射BL重組腫瘤細(xì)胞，再成像進(jìn)行監(jiān)測(cè)。 另一種方式，初期的腫瘤和不確定的轉(zhuǎn)移可以通過使用基因工程的發(fā)光細(xì)胞作為探針進(jìn)行定位。 
a human colon carcinoma xenograft 模式中已經(jīng)開始使用雙標(biāo)記，一個(gè)標(biāo)記檢測(cè)特定基因的轉(zhuǎn)錄活性，另一個(gè)組成性表達(dá)，作為一個(gè)內(nèi)參照物。

10. 細(xì)胞移植 
心臟細(xì)胞移植中胚胎心臟成肌細(xì)胞的位置、數(shù)量和存活時(shí)間可以在活體動(dòng)物中進(jìn)行非侵入行的監(jiān)測(cè)。 體內(nèi)BL成像同樣提供了一種新的可以動(dòng)態(tài)檢測(cè)移植的人造血干細(xì)胞的方法。其他的生物學(xué)過程同樣可以通過BL標(biāo)記后活體成像進(jìn)行研究，比如細(xì)胞凋亡、蛋白-蛋白互作和效應(yīng)細(xì)胞功能等等。使用這種方法可以在活體中進(jìn)行客觀的、可定量的檢測(cè)，成為藥物篩選的一個(gè)重要工具。

11．生物發(fā)光傳感器 
BL被作為一個(gè)檢測(cè)系統(tǒng)在生物傳感器中使用，嚴(yán)格意義上是指作為生物識(shí)別系統(tǒng)中的分析裝置并與傳導(dǎo)裝置接觸，相關(guān)的酶被固定在各種不同形式的裝置上。這些系統(tǒng)主要是基于耦連的酶促反應(yīng)并引發(fā)光子的發(fā)射。