微透析技術(shù)在生命科學(xué)中的應(yīng)用綜述

 

摘要：
近幾十年來利用微透析技術(shù)在許多組織中開展了監(jiān)測內(nèi)源性及外源性物質(zhì)濃度及其含量的研究。該技術(shù)已經(jīng)逐漸顯示出其能直接且在線反映某物質(zhì)在組織器官中信息的特點，同時微透析技術(shù)對組織器官是安全的，因其產(chǎn)生的損傷機體具有良好的耐受性。本文主要綜述了微透析技術(shù)原理及其在疾病進展監(jiān)測等臨床研究領(lǐng)域應(yīng)用，同時展望了該技術(shù)在職業(yè)性疾病研究中的應(yīng)用前景。

 

微透析技術(shù)是近四、五十年發(fā)展起來的實驗技術(shù)，由于可通過透析液與細胞外液的滲透交換作用，精確地獲取局部組織的代謝、排泌信息，故在生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究中得到愈來愈廣泛的應(yīng)用。目前，多數(shù)文獻集中于利用微透析技術(shù)研究組織細胞代謝、細胞因子和介質(zhì)排泌狀況。實際上，利用此項技術(shù)可獲取的信息遠不止于此，重要器官組織有關(guān)醫(yī)藥、農(nóng)藥、金屬元素、環(huán)境污染物及上述物質(zhì)代謝產(chǎn)物的詳細信息均可利用本項技術(shù)獲得。因此，微透析技術(shù)在環(huán)境和職業(yè)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域似有著更廣闊的發(fā)展天地。本文對其基本原理和應(yīng)用情況作一概述。

 

微透析(microdilaysis)一詞起源于20世紀(jì)50年代末期，當(dāng)時是用來描述一種類似于透析的萃取技術(shù)。最初主要用于生物化學(xué)微量檢測，人們能從不足1mL血漿中分離出膽固醇，之后又逐漸應(yīng)用于其他領(lǐng)域，1974年UNGERSTEDE和PYCOCK首次利用該技術(shù)對大鼠腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)多巴胺進行研究。目前它已經(jīng)成為重要的實驗研究技術(shù)，用于離體實驗或體內(nèi)實驗的內(nèi)源性、外源性化學(xué)物質(zhì)濃度變化的分析研究。

 

微透析實驗技術(shù)采用具有截留不同相對分子質(zhì)量物質(zhì)性能的纖維半透膜制成極細的微透析探頭(micordilaysisprobe MDP)，埋入待測的組織區(qū)域內(nèi)，再以恒定的速率向探頭內(nèi)灌注與組織液成分相近的等滲灌流液；當(dāng)灌流液流經(jīng)探頭前端透析膜時，位于探頭膜外側(cè)組織內(nèi)相對分子質(zhì)量較小的生物活性物質(zhì)，將依濃度梯度從膜外擴散入膜內(nèi)，并隨灌流液引流出探頭；以一定的時間間隔有序地接收透析液，采用高靈敏度化學(xué)檢測系統(tǒng)連續(xù)檢測收集的透析液中待測生物活性物質(zhì)濃度，便可有效監(jiān)測活體動物或人體特定組織區(qū)域內(nèi)細胞外生物活性物質(zhì)的動態(tài)變化情況。

 

早期微透析探頭(多為簡單的透析纖維管或u型探頭和I型探頭)對組織損傷較大；近年一種新型同心圓I型探頭，則可廣泛用于腦、血管和重要組織的微透析分析。欲采集的樣品可經(jīng)過探針頂端的半透膜進入收集管(外管)形成“透析液”流出。當(dāng)灌流液流經(jīng)透析膜時，不同分子根據(jù)其濃度的大小不同或從灌流液中擴散出來(稱為“逆透析”)或由組織外液進入(回

收)透析液。

 

微透析出來的待檢物質(zhì)濃度畢竟不能確切代表受檢組織中該物質(zhì)的實際濃度；且由于使用不含待測成分的灌流液不斷進行灌注，因此永遠也達不到平衡狀態(tài)，提示從微透析液檢測到的濃度只能是該部位體液真實濃度的“片斷”，該物質(zhì)在受檢組織中的濃度應(yīng)恒定地大于灌流液中該物質(zhì)的濃度，二者的比率即是所謂“相對回收率”。

 

2．1溫度

通透膜的物質(zhì)彌散速率與溫度呈正比l3，根據(jù)StokesEinstein方程：彌散系數(shù)D=kh(6Ⅱ)，其中，kb為Boltzmann常數(shù)，彌散系數(shù)與溫度(T)呈正比，與液體黏滯度(叩)和粒子直徑呈反比，為圓周系數(shù)，提示溫度越高透析物質(zhì)的通透率也越高。

2．2膜面積和截留分子量

只有相對分子質(zhì)量低于透析膜截留閾的物質(zhì)才能通過透析膜，從實驗的可信度來說，只有相對分子質(zhì)量低于透析膜截留閾值1／4的物質(zhì)，其相對回收率在實驗中才有意義。

2．3透析物質(zhì)的濃度

根據(jù)Fick擴散定律很容易理解：所透析物質(zhì)的濃度越高，其相對回收率也越高。

2．4灌流液的成分

在微透析實驗中，環(huán)境溫度、通透膜性能、待透析的物質(zhì)均已確定，灌流液成分則可以根據(jù)實驗需要而變化。灌流液的制備過程中應(yīng)根據(jù)待透物質(zhì)的特性而有所選擇，目的是取得最佳的分析結(jié)果。目前國際上多采用人工腦脊液(ACSF)、Ringer液或Krebs液作為腦微透析的灌流液，而用生理鹽水作為非神經(jīng)組織灌流液。不同的透析樣品可根據(jù)其性質(zhì)在灌流液中加入不同的物質(zhì)以利樣品分析。如測定肽類活性物質(zhì)，可在灌流液中加入0．5％牛血清白蛋白，減少其對透析系統(tǒng)的黏附；單胺類神經(jīng)遞質(zhì)及其代謝產(chǎn)物在光照、常溫和pH>3．5條件下極易氧化，可在樣品收集管中加入微量醋酸，使收集的樣品液pH值保持在3．5以下，并在冰浴、避光條件下收集樣品，可有效避免樣品中去甲腎上腺素、多巴胺及5一羥色胺等物質(zhì)的氧化。以上對回收率影響因素的控制不僅增加了微透析技術(shù)可檢測物質(zhì)的種類，也有助于減少系統(tǒng)誤差。

2．5灌流速度

影響相對回收率的另一重要因素是透析灌流速度�？偟膩碚f，低流速能增加相對回收率，高流速會降低回收率。但KJELLSTROM等人1998年在實驗中發(fā)現(xiàn)，有時實驗結(jié)果會出現(xiàn)與此相悖的現(xiàn)象：當(dāng)流速<1gL／min時，白三烯的相對回收率會降低，作者認為可能與該流速條件下透析膜的吸收過程發(fā)生變化有關(guān)。由于微透析實驗樣品收集體積相對較少，而且受到分析手段的限制，因此低流速取樣通常難以達到實驗需求；但較大的流速(比如10gL／min或更高)，則可能引起“超濾”現(xiàn)象，即在一較高流速條件下，取得的樣品并非有效成分的物理擴散，而是高流速形成的高濾過壓產(chǎn)生的一種“凈流動”。因此，微透析實驗中灌流液的流速一般宜控制在0．5～5gL／min。

2．6收集樣品管路扭曲程度

與離體實驗比較，在體微透析實驗的相對回收率會降低，因為在體實驗中微透析的實驗管路本身也存在一定的阻力，尤其是當(dāng)實驗動物自由活動時管路可能會發(fā)生扭曲，此時阻力更

大，得到的實驗結(jié)果可能會失真。

 

3．1給藥方案設(shè)計

抗癌藥物的療效與腫瘤組織中的藥物濃度密切相關(guān)。以前藥物在腫瘤中的濃度很難直接測到，所以通常用血藥濃度來預(yù)測和評價藥物的抗癌效果，但由于腫瘤組織的特殊生理情況

在多數(shù)情況下，腫瘤的藥物濃度與血藥濃度并不一致。微透析技術(shù)可以在腫瘤組織直接采取藥樣，因此在設(shè)計抗癌藥物給藥方案、研究抗癌藥物在腫瘤中的代謝等方面占有很大的優(yōu)

勢。

3．2顱腦損傷監(jiān)測

20世紀(jì)90年代以來，微透析技術(shù)越來越多地應(yīng)用于腦損傷以及手術(shù)過程監(jiān)測，為臨床提供了腦損傷和顱腦手術(shù)過程中腦代謝變化的多方面信息。1966年BITO等人首次使用微透析技術(shù)將一種灌有液體的半透膜裝置植入犬體內(nèi)進行試驗；1992年P(guān)ERSSON和HILLERED等人首次將微透析技術(shù)用于神經(jīng)重癥監(jiān)護中，觀察了3例嚴(yán)重腦損傷和1例嚴(yán)重蛛網(wǎng)膜下隙出血患者病情發(fā)展和藥物干預(yù)過程中，能量代謝相關(guān)物質(zhì)以及一些氨基酸的變化情況。2003年只達石等人在國內(nèi)首次報道應(yīng)用微透析技術(shù)觀察了7例顱腦創(chuàng)傷患者腦細胞間液中有關(guān)代謝產(chǎn)物的變化情況，以及亞低溫治療對上述指標(biāo)的影響。近年還有文獻報道采用微透析技術(shù)研究動脈瘤破裂引起的動脈瘤性蛛網(wǎng)膜下隙出血患者，在腦血管痙攣、腦缺血或遲發(fā)性缺血神經(jīng)功能障礙等狀況下，腦細胞外液的生化物質(zhì)變化情況。微透析監(jiān)測能提供更多有關(guān)腦代謝方面的信息，且安全可靠。

3. 3其他疾病的監(jiān)測

除用于腦外傷后的缺血監(jiān)測，微透析技術(shù)還被用于監(jiān)測心臟手術(shù)后患者肌鈣蛋白T和天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶濃度，時間可長達100hE。心肌中上述指標(biāo)的改變與心電圖的改變十分一致；血清中上述指標(biāo)達到峰值需要1h，微透析技術(shù)則可隨時測知。腸道缺血是另一種嚴(yán)重且難以確診的病癥，在臨床癥狀出現(xiàn)前尤其如此，現(xiàn)在則可用微透析技術(shù)進行監(jiān)測。在整形手術(shù)中，微透析技術(shù)可用于及早發(fā)現(xiàn)重建皮瓣有無缺血。

 

環(huán)境及職業(yè)性毒物已成為當(dāng)前醫(yī)學(xué)研究的重要熱點，其種類繁多，作用機制復(fù)雜。建立更優(yōu)化、靈敏的檢測和評價方法，進一步了解其對人類健康的影響以及作用機制，才能有針對性地提出合理的預(yù)防治療措施，減少這些毒物對人體的危害。長期低劑量暴露是環(huán)境性或職業(yè)性毒物接觸的特點，其造成生理生化改變十分隱匿，目前還缺少有效和靈敏的評價方法和分析手段。微透析檢驗技術(shù)創(chuàng)傷輕微，不破壞機體完整性，不易引起組織感染及組織部位容積變化，能長時間連續(xù)取樣，樣品相對純凈(不含蛋白質(zhì)、酶等生物大分子物質(zhì))可不經(jīng)預(yù)處理，可實現(xiàn)在線樣品分析，測定結(jié)果可真實代表取樣位點目標(biāo)化含物的濃度，并可獲得有關(guān)代謝中間過程的信息。隨著微透析技術(shù)的進步和實踐經(jīng)驗的積累，可以預(yù)料，在不久的將來，微透析技術(shù)將會迅速介入環(huán)境和職業(yè)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，而使這一醫(yī)學(xué)科學(xué)又獲得一個更得力的工具。

 

(文章來源：環(huán)境與職業(yè)醫(yī)學(xué) 第25卷第1期  作者 關(guān)里 等）