采用ACQUITY UPLC H-Class系統(tǒng)的多元溶劑混合能力開(kāi)發(fā)肽譜圖分析方法

目標(biāo)

ACQUITY UPLC ® H- Class 系統(tǒng)采用四元溶劑混合的自動(dòng)化優(yōu)化方案，對(duì)肽譜分析條件進(jìn)行系統(tǒng)性優(yōu)化。

背景

肽譜分析用于確認(rèn)某種蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)，識(shí)別翻譯后修飾（PTM），并分析雜質(zhì)。任何蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)差異反映在含有該修飾的肽保留時(shí)間的變化中。

某種蛋白質(zhì)的完整結(jié)構(gòu)定性，需要能夠分辨 100 或者 100 個(gè)以上的多肽分辨率，這些多肽的分子大小和分子特性跨度范圍很大。當(dāng)開(kāi)發(fā)分離這些肽段的分離條件時(shí)，包括改變流動(dòng)相組成和有機(jī)溶劑組成的變化。而且每項(xiàng)測(cè)定條件要求制備一對(duì)混合溶劑，該溶劑涉及兩項(xiàng)或者三項(xiàng)準(zhǔn)確的量度。

采用 ACQUITY UPLC H- Class 系統(tǒng)進(jìn)行四元溶劑的混合，混合溶劑的產(chǎn)生是由系統(tǒng)從純?nèi)軇┢恐谐槌龌旌隙�成。此方式減少了制備許多溶劑混合物的工作量，而且使得出錯(cuò)的可能性最小化。同時(shí)能夠簡(jiǎn)易地測(cè)定中間組分。

ACQUITY UPLC H- Class 系統(tǒng)簡(jiǎn)化了可用于定性蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)的肽圖譜分析方法的開(kāi)發(fā)和優(yōu)化。

ACQUITY UPLC H-Class 系統(tǒng)以及它的四元溶劑混合能力旨在幫助客戶關(guān)注分析的質(zhì)量 , 高效地獲取可靠的結(jié)果。

溶液

采用 ACQUITY UPLC BEH 300 C 18 色譜柱和多重流動(dòng)相溶劑分離 MassPREP TM 烯醇酶的胰蛋白酶酶解肽段標(biāo)準(zhǔn)品。在 ACQUITY UPLC H-Class 系統(tǒng)中，我們?cè)O(shè)置水為 A 路溶劑，乙腈為 B 路溶劑，異丙醇為 C 路溶劑， 1% 的 TFA 水溶液作為 D 路溶劑。為了評(píng)估酸濃度的效果，三種相同梯度的乙腈升高洗脫梯度分別在 2.5% ， 5% 和 10% 的 D 條件下運(yùn)行，象對(duì)應(yīng)的 TFA 的濃度分別為 0.025% ， 0.05% ，以及 0.1% 。

烯醇酶多肽消化標(biāo)準(zhǔn)

柱：多肽分離技術(shù) BEH 300 C 18 ， 2.1X 100mm ， 1.7 μm

溶劑： A: 水， B: 乙腈， C ：異丙醇， D:1% TFA

圖 1. 溶劑組成可使用 ACQUITY UPLC H- Class 系統(tǒng)的 Aut o · Blend TM 功能簡(jiǎn)易地進(jìn)行調(diào)節(jié)。在本例中，肽圖譜的 TFA 最佳濃度僅僅通過(guò)改變從 D 線取得的流量百分比的變化而確定的。沒(méi)有必要制備更多瓶的溶劑，而且可花費(fèi)最少的勞動(dòng)測(cè)定中間值。

圖 2. 使用 ACQUITY UPLC H- Class 系統(tǒng)的自動(dòng)混合功能從純?nèi)軇┢恐刑崛〖內(nèi)軇┗旌铣扇軇┗旌衔铩?

圖 1 中的色譜層析結(jié)果顯示了隨著酸濃度的變化，色譜選擇性的顯著變化。該實(shí)驗(yàn)可以通過(guò)重復(fù)相同的實(shí)驗(yàn)但使用遞增的異丙醇梯度進(jìn)行拓展，其能夠通過(guò)運(yùn)行溶劑 A （水）到溶劑 C （異丙醇）的梯度方便地實(shí)施，而溶劑 D 的濃度保持恒定，與先前實(shí)驗(yàn)中的濃度一致。溶劑從乙腈變?yōu)楫惐�醇縮短了留柱時(shí)間 , 同時(shí)也顯著改變了選擇性。

該系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)了六種不同的流動(dòng)相配方以確認(rèn)最佳的肽圖譜。選擇性的改變可用于獲得混合物中的關(guān)鍵多肽的最佳分辨率。如果使用二元體系或者使用開(kāi)關(guān)閥進(jìn)行這些實(shí)驗(yàn)，科學(xué)家們需要制備 12 瓶流動(dòng)相溶液，至少需要 24 項(xiàng)體積量度。當(dāng)采用 ACQUITY UPLC H- Class 系統(tǒng)時(shí)，僅使用了一種混合物，使用與三瓶純?nèi)軇┫嗦?lián)系的兩種度量體積（圖 2 ）。 ACQUITY UPLC H- Class 系統(tǒng)可減少工作量，工作的時(shí)間，以及錯(cuò)誤存在的可能性，以達(dá)到優(yōu)化的分離條件。

總結(jié)

生物化學(xué)家能夠采用 ACQUITY UPLC H- Class 系統(tǒng)有效地開(kāi)發(fā)用于定性蛋白質(zhì)的肽圖譜分析方法。該系統(tǒng)使用便捷的四溶劑混合能力輔助用戶關(guān)注于分析的質(zhì)量，使其能夠有效地開(kāi)發(fā)完備的 , 可靠的分離方法。 ACQUITY UPLC H- Class 系統(tǒng)結(jié)合了 UPLC 分離原理和靈活的設(shè)備操作，以獲取最佳的生物分離結(jié)果。