納米免疫抗體制備技術(shù)的常見難點解答

問題1：蛋白質(zhì)不穩(wěn)定或難以溶解，以及難以保持其原生態(tài)構(gòu)象。

 

答：

①、優(yōu)化蛋白表達(dá)條件：

使用適宜的宿主系統(tǒng)：不同的蛋白表達(dá)系統(tǒng)（如大腸桿菌、酵母、昆蟲細(xì)胞或哺乳動物細(xì)胞）具有不同的優(yōu)點，選擇最適合目標(biāo)蛋白的表達(dá)系統(tǒng)可以提高其穩(wěn)定性和溶解性。

調(diào)整表達(dá)條件：改變誘導(dǎo)表達(dá)的溫度：表達(dá)過程中的溫度控制會影響蛋白質(zhì)的溶解度，可通過降低表達(dá)溫度（例如，從 37°C 改為 18°C）可以促進(jìn)正確的蛋白質(zhì)折疊并減少包涵體形成；優(yōu)化誘導(dǎo)時間以平衡蛋白質(zhì)產(chǎn)量和聚集， 當(dāng)誘導(dǎo)時間較短時就可以減少聚集；添加輔助物質(zhì)（如分子伴侶），有助于提高蛋白的穩(wěn)定性和溶解性。

②、蛋白純化和穩(wěn)定化：

緩沖劑和穩(wěn)定劑：在純化過程中和純化后，使用含有適當(dāng)?shù)柠}類、pH緩沖劑和有助于穩(wěn)定蛋白構(gòu)象的穩(wěn)定劑（如甘油、蔗糖或其他兼容溶劑）。

蛋白質(zhì)濃度： 為了防止聚集，在純化步驟中應(yīng)避免高蛋白質(zhì)濃度。

溫和的純化條件：使用盡可能溫和的洗脫條件（例如，漸進(jìn)的鹽濃度梯度）以維持蛋白的活性和構(gòu)象。在純化過程的早期采用溫和純化技術(shù)，例如尺寸排阻色譜 (SEC)，以去除聚集物。

③、使用融合標(biāo)簽或伴侶蛋白：

融合標(biāo)簽：使用溶解性標(biāo)簽（如GST或MBP）可以增加目標(biāo)蛋白的溶解性。此外，某些標(biāo)簽還可以幫助蛋白質(zhì)折疊成其活性形式，如有必要，可以在純化后除去這些標(biāo)簽。

分子伴侶：共表達(dá)分子伴侶可以幫助正確折疊目標(biāo)蛋白并防止其聚集。共表達(dá)分子伴侶或折疊輔助蛋白（例如大腸桿菌中的 GroEL/ES）以協(xié)助正確的蛋白質(zhì)折疊。

④、構(gòu)建穩(wěn)定性突變體：

突變分析：通過生物信息學(xué)工具預(yù)測可能的不穩(wěn)定區(qū)域，并通過定點突變來增強蛋白的熱穩(wěn)定性或溶解性，如果可能的話，引入二硫鍵，以幫助穩(wěn)定蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)。

⑤、免疫原設(shè)計：

使用構(gòu)象表位：如果目標(biāo)是產(chǎn)生針對特定三維結(jié)構(gòu)的抗體，可以設(shè)計包含這些構(gòu)象表位的多肽，即使是在更大的蛋白質(zhì)不穩(wěn)定的情況下也是如此。

 

問題2：低蛋白表達(dá)產(chǎn)量會限制可用于免疫的免疫原量。

 

答：

1. 密碼子優(yōu)化：

密碼子優(yōu)化是增強異源表達(dá)系統(tǒng)中蛋白質(zhì)表達(dá)的常見策略。 針對您正在使用的特定表達(dá)系統(tǒng)優(yōu)化目標(biāo)基因的密碼子使用， 商業(yè)軟件或在線工具可以幫助密碼子優(yōu)化。

2. 強啟動子：

選擇或設(shè)計驅(qū)動更高基因表達(dá)水平的強啟動子。 啟動子的選擇可以極大地影響表達(dá)產(chǎn)量。

3. 優(yōu)化誘導(dǎo)：

微調(diào)誘導(dǎo)條件，包括誘導(dǎo)劑的濃度和時間（例如，大腸桿菌的 IPTG）。 逐漸誘導(dǎo)或降低誘導(dǎo)溫度有時可以提高蛋白質(zhì)產(chǎn)量。

4. 宿主菌株選擇：

特定表達(dá)系統(tǒng)內(nèi)的不同宿主菌株可能具有不同的表達(dá)能力。 選擇針對高蛋白表達(dá)進(jìn)行優(yōu)化的宿主菌株。

 

問題3：某些蛋白質(zhì)本身可能沒有足夠的免疫原性，或者蛋白樣品存在污染

 

答：

1. 增強蛋白質(zhì)的免疫原性：

使用佐劑： 將佐劑（例如弗氏佐劑或氫氧化鋁）納入免疫方案中。 佐劑有助于刺激對蛋白質(zhì)更強的免疫反應(yīng)。

多次免疫接種： 定期進(jìn)行多次免疫接種，以隨著時間的推移增強免疫反應(yīng)。

與載體蛋白綴合： 將靶蛋白與載體蛋白（例如血藍(lán)蛋白、牛血清白蛋白）綴合以增加免疫原性。 這對于小或免疫原性差的蛋白質(zhì)特別有用。

表位標(biāo)簽的使用： 將抗原表位標(biāo)簽附加到蛋白質(zhì)上以增強免疫系統(tǒng)的識別。 常見標(biāo)簽包括 FLAG、HA 或 c-Myc 標(biāo)簽。

肽免疫原： 不使用全長蛋白質(zhì)，而是設(shè)計和合成代表蛋白質(zhì)抗原區(qū)域的免疫原性肽。

2. 去除蛋白質(zhì)樣品中的污染物：

純化優(yōu)化： 重新優(yōu)化蛋白質(zhì)純化過程以去除污染物。 使用額外的純化步驟或特定的色譜技術(shù)。

超濾和透析： 采用超濾或透析方法去除小分子量污染物，例如鹽或小分子。

Protein A/G 柱： 使用 Protein A 或 Protein G 柱進(jìn)行免疫球蛋白的親和純化。 即使存在污染蛋白質(zhì)，這也有助于分離特異性抗體。

尺寸排阻色譜法 (SEC)： 執(zhí)行尺寸排阻色譜法，根據(jù)蛋白質(zhì)的尺寸和分子量來分離蛋白質(zhì)。 這樣可以有效去除較大的污染物。

3. 蛋白質(zhì)工程：

誘變： 修改蛋白質(zhì)序列以消除或最小化可能導(dǎo)致免疫原性差或不穩(wěn)定的區(qū)域。 確保保留必要的表位。

融合蛋白： 將目標(biāo)蛋白與更具免疫原性或穩(wěn)定的伴侶融合，例如抗原性不同的蛋白或載體蛋白。

 

問題4：小分子本身免疫原性差，難以激發(fā)有效的免疫反應(yīng)。

 

答：

①、偶聯(lián)到載體蛋白：

選擇適當(dāng)?shù)妮d體蛋白：常用的載體蛋白包括KLH（血藍(lán)蛋白）、BSA（牛血清白蛋白）和OVA（雞卵白蛋白）等。這些大分子蛋白可以攜帶多個小分子表位，增強小分子的免疫原性。

化學(xué)偶聯(lián)：通過化學(xué)方法將小分子與載體蛋白鏈接，常用的偶聯(lián)方法有羧基與胺基的偶聯(lián)、親和標(biāo)簽（如Histag）的利用等。

②、使用佐劑：

選擇合適的佐劑：佐劑可以增強免疫系統(tǒng)對免疫原的反應(yīng)。例如，基于油的佐劑（如Freund's adjuvant）能產(chǎn)生更強的細(xì)胞介導(dǎo)免疫反應(yīng)，而基于水的佐劑（如鋁鹽）傾向于激發(fā)更高水平的體液免疫反應(yīng)。

③、多表位設(shè)計：

結(jié)合不同的小分子表位：通過設(shè)計包含多種不同表位的長肽或多肽，可以同時針對多個表位產(chǎn)生免疫反應(yīng)，提高小分子整體的免疫原性。

④、分子修飾：

改進(jìn)小分子結(jié)構(gòu)：通過化學(xué)修飾增加小分子的親和力或穩(wěn)定性，如增加親脂性鏈條，可以幫助它們更好地結(jié)合到免疫系統(tǒng)的分子上。

 

問題5：線性多肽的免疫原性較差，且在體內(nèi)穩(wěn)定性低。

 

答：

①、偶聯(lián)到載體蛋白：

將線性多肽與大分子載體蛋白（如KLH、BSA或OVA）偶聯(lián)，可幫助提高其整體的免疫原性。載體蛋白能提供更大的體積和更多的淋巴細(xì)胞表位，從而強化免疫反應(yīng)。

②、多肽的環(huán)化：

環(huán)狀多肽比其線性對應(yīng)物通常更穩(wěn)定，更不易被蛋白酶降解。環(huán)化可以通過在多肽的兩端引入化學(xué)交聯(lián)或形成穩(wěn)定的二硫鍵來實現(xiàn)。

③、使用佐劑：

佐劑是特殊的化合物，它們可以刺激免疫反應(yīng)并增加免疫原性。例如，F(xiàn)reund's adjuvant是一種常用的強效佐劑，經(jīng)常被用于初次免疫和加強免疫。

④、增加多肽長度：

較長的多肽可能含有更多的T細(xì)胞和B細(xì)胞表位，從而激發(fā)更強烈的免疫反應(yīng)。但需平衡多肽長度和可能的增加的合成難度或成本。

⑤、共價結(jié)合穩(wěn)定劑：

通過與多肽共價結(jié)合的穩(wěn)定劑可以提高其在體內(nèi)的穩(wěn)定性。例如，聚乙二醇（PEG）是一種常用的穩(wěn)定劑，可降低蛋白酶的降解。